Metabolitonan imunomodulador ta un karakterístika klave di e mikroambiente di tumor (TME), pero ku algun eksepshon, nan identidatnan ta keda pa gran parti deskonosí. Aki, nos a analisá tumornan i sèlnan T for di e tumornan i ascites di pashèntnan ku karsinoma seroso di grado haltu (HGSC) pa revelá e metaboloma di e diferente kompartimentunan di TME aki. Ascites i celnan di tumor tin diferensianan ekstenso di metabolito. Kompará ku ascites, e sèlnan T ku ta infiltrá den tumor ta signifikantemente enrikesé den 1-methylnicotinamide (MNA). Aunke e nivel di MNA den celnan T ta elevá, e ekspreshon di nicotinamide N-metiltransferasa (un enzima ku ta katalisá e transferensia di gruponan metil di S-adenosylmetionine pa nicotinamide) ta limitá na fibroblast i celnan di tumor. Funshonalmente, MNA ta indusí sèlnan T pa sekretá e faktor alfa di nekrosis di tumor di sitokina ku ta promové tumor. P’esei, MNA derivá di TME ta kontribuí na e regulashon imunológiko di celnan T i ta representá un potensial meta di imunoterapia pa tratamentu di kanser humano.
Metabolitonan derivá di tumor por tin un efekto inhibitorio profundo riba imunidat anti-tumor, i mas i mas evidensia ta mustra ku nan por sirbi tambe komo un forsa klave pa progreso di malesa (1). Ademas di e efekto di Warburg, trabounan resien a kuminsá pa karakterisá e estado metabóliko di celnan di tumor i su relashon ku e estado inmune di e mikroambiente di tumor (TME). Estudionan riba modelonan di raton i celnan T humano a mustra ku metabolismo di glutamina (2), metabolismo oxidativo (3) i metabolismo di glukosa (4) por aktua independientemente riba vários subgrupo di celnan inmune. Varios metabolito den e trayektonan aki ta inhibi e funshon anti-tumor di celnan T. A keda probá ku e blokeo di e koenzima tetrahidrobiopterin (BH4) por daña e proliferashon di celnan T, i e oumento di BH4 den e kurpa por mehorá e kontesta inmune anti-tumor media pa CD4 i CD8. Ademas, e efekto imunosupresivo di kynurenine por wòrdu reskatá dor di e atministrashon di BH4 (5). Den glioblastoma mutante di isocitrate dehydrogenase (IDH), e sekreshon di enantiometaboliko (R)-2-hidroksiglutarato (R-2-HG) ta inhibi aktivashon, proliferashon i Aktividat di sitolisis di sèl T (6). Resientemente, a keda demostrá ku metilglioksal, un subprodukto di glikólisis, ta wòrdu produsí dor di celnan supresor di orígen mieloide, i transferensia di sèl T di metilglioksal por inhibi funshon di sèl T efektor. Den tratamentu, e neutralisashon di metilglioksal por superá e aktividat di sèlnan supresor derivá di mieloide (MDSC) i mehorá sinérgikamente terapia di blokeo di punto di kòntròl den modelonan di raton (7). E estudionan aki kolektivamente ta enfatisá e ròl klave di metabolitonan derivá di TME den regulashon di funshon i aktividat di sèl T.
Disfunshon di sèl T a wòrdu raportá ampliamente den kanser di ovario (8). Esaki ta parsialmente debí na e karakterístikanan metabóliko inherente na hipóksia i vaskulatura abnormal di tumor (9), ku ta resultá den e kombershon di glukosa i triptofano den subproduktonan manera ácido láctico i kynurenina. Laktato ekstraselular eksesivo ta redusí e produkshon di interferon-γ (IFN-γ) i ta impulsá e diferensiashon di subgruponan mielosupresivo (10, 11). E konsumo di triptofan ta inhibi proliferashon di sèl T direktamente i ta inhibi señalisashon di reseptor di sèl T (12-14). Apesar di e opservashonnan aki, hopi trabou rondó di metabolismo inmunológiko a wòrdu realisá den kultura di sèl T in vitro usando medionan optimalisá, òf limitá na modelonan di raton homólogo in vivo, di kua ningun ta reflehá kompletamente e heterogeneidat di kansernan humano i ambiente makro i mikro Fisiológiko.
Un karakterístika komun di kanser di ovario ta plamamentu peritoneal i e aparensia di ascites. E akumulamentu di líkido di cel den ascites ta asosiá ku malesa avansá i mal pronóstiko (15). Di akuerdo ku informenan, e kompartimentu úniko aki ta hipóksiko, tin nivelnan haltu di faktor di kresementu endotelial vaskular (VEGF) i indoleamine 2,3-dioxigenase (IDO), i ta wòrdu infiltrá pa celnan regulatorio T i celnan inhibidor mieloide (15-18). E ambiente metabóliko di ascites por ta diferente for di esun di e tumor mes, pues e reprogramashon di celnan T den e espasio peritoneal no ta kla. Ademas, e diferensianan klave i heterogenidat entre ascites i metabolitonan presente den e ambiente di tumor por stroba e infiltrashon di celnan inmune i nan funshon riba tumornan, i mas investigashon ta nesesario.
Pa por solushoná e problemanan aki, nos a diseñá un método di separashon di cel sensitivo i kromatografia líkido di spektrometria di masa tandem (LC-MS/MS) pa studia diferente tipo di cel (inkluso CD4 + i CD8 + T cells) i tambe den i entre tumornan Su metabolitonan ta abarká celnan den e mesun ambiente di ascite i tumor di e pashènt. Nos ta usa e método aki konhuntamente ku sitometria di fluho di dimenshon haltu i sekuensiamentu di RNA di un solo sèl (scRNA-seq) pa duna un potrèt altamente resolvé di e status metabóliko di e poblashonnan klave aki. E método aki a revelá un oumento signifikante den e nivel di 1-methylnicotinamide (MNA) den celnan T di tumor, i eksperimentonan in vitro a mustra ku e efekto imunomodulatorio di MNA riba funshon di celnan T tabata deskonosí anteriormente. En general, e método aki ta revelá e interakshonnan metabóliko mutuo entre tumornan i celnan inmunológiko, i ta duna bista úniko riba metabolitonan di regulashon inmunológiko, ku por ta útil pa e tratamentu di oportunidatnan di tratamentu di imunoterapia di kanser di ovario basá riba sèl T.
Nos a usa sitometria di fluho di dimenshon haltu pa kalkulá simultáneamente e absorshon di glukosa [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) i aktividat mitokondrial [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (2017, 2019) ta na banda markadónan típiko ku ta distinguí celnan inmune i poblashonnan di celnan di tumor (Tabela S2 i Figura S1A). E analisis aki a mustra ku kompará ku celnan T, ascites i celnan di tumor tin nivelnan di absorshon di glukosa mas haltu, pero tin diferensianan mas chikitu den aktividat mitokondrial. E absorshon promedio di glukosa di celnan di tumor [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ta tres pa kuater biaha esun di celnan T, i e absorshon promedio di glukosa di celnan T CD4 + ta 1.2 biaha esun di celnan CD8 + T, loke ta indiká ku linfositonan infiltrante di tumor (TIL) tin diferente rekisito metabóliko asta den e mesun figura TAME (Figura 1). Na kontraste, e aktividat mitokondrial den celnan di tumor ta similar na esun di celnan CD4 + T, i e aktividat mitokondrial di tur dos tipo di cel ta mas haltu ku esun di celnan CD8 + T (Figura 1B). En general, e resultadonan aki ta revelá e nivel metabóliko. E aktividat metabóliko di celnan di tumor ta mas haltu ku esun di celnan CD4 + T, i e aktividat metabóliko di celnan CD4 + T ta mas haltu ku esun di celnan T CD8 +. Apesar di e efektonan aki entre tiponan di cel, no tin diferensia konsistente den e status metabóliko di CD4 + i CD8 + T celnan òf nan proporshonnan relativo den ascites kompará ku tumornan (Figura 1C). Na kontraste, den e frakshon di sèl CD45, e proporshon di sèlnan EpCAM+ den e tumor a oumentá kompará ku ascites (Figura 1D). Nos a opservá tambe un diferensia metabóliko kla entre komponentenan di sèl EpCAM+ i EpCAM-. Sèlnan EpCAM+ (tumor) tin un absorshon di glukosa i aktividat mitokondria mas haltu ku sèlnan EpCAM-, ku ta muchu mas haltu ku e aktividat metabóliko di fibroblastonan den sèlnan di tumor den TME (Figura 1, E i F).
(A i B) Intensidat di fluorescencia mediano (MFI) di e absorshon di glukosa (2-NBDG) (A) i aktividat mitokondrial di CD4 + T cells (MitoTracker kòrá skur) (B) Gráfikonan representativo (na robes) i datonan tabulá (Drechi), CD8 + T cells i EpCAM + CD45-celnan di tumor komo sito i tumor. (C) E proporshon di celnan CD4 + i CD8 + (di celnan T CD3 +) den ascites i tumor. (D) Proporshon di EpCAM + celnan di tumor den ascites i tumor (CD45−). (E i F) EpCAM + CD45-tumor i EpCAM-CD45-matrix glucose uptake (2-NBDG) (E) i aktividat mitokondrial (MitoTracker kòrá skur) (F) grafikonan representativo (na robes) i datonan tabulá (Drechi) Ascites i sèlnan di tumor. (G) Grafikonan representativo di ekspreshon di CD25, CD137 i PD1 pa medio di sitometria di fluho. (H i I) Ekspreshon di CD25, CD137 i PD1 riba sèlnan CD4 + T (H) i sèlnan T CD8 + (I). (J i K) Fenotiponan di memoria sentral (Tcm), efektor (Teff) i memoria efektor (Tem) basá riba e ekspreshon di CCR7 i CD45RO. Imágennan representativo (na robes) i datonan tabular (na drechi) di CD4 + T cells (J) i CD8 + T cells (K) den ascites i tumornan. Balornan di P determiná pa t-test pareá (*P<0.05, **P<0.01 i ***P<0.001). E liña ta representá pashèntnan pareu (n = 6). FMO, fluorescencia menos un; MFI, intensidat di fluoresensia mediano.
Mas analisis a revelá otro diferensianan signifikante entre e status fenotípiko di sèl T altamente resolvé. E memoria aktivá (Figura 1, G pa I) i efektor (Figura 1, J i K) den tumornan ta muchu mas frekuente ku ascites (proporshon di sèlnan CD3 + T). Di mes manera, analisando e fenotipo dor di e ekspreshon di markadónan di aktivashon (CD25 i CD137) i markadónan di agotamentu [proteina di morto di cel programá 1 (PD1)] a mustra ku ounke e karakterístikanan metabóliko di e poblashonnan aki ta diferente (Figura S1, B pa E), Pero no a opservá diferensianan metabóliko signifikante konsistentemente entre e efektonan nativo, òf memoria nativo, òf subkonhunto (Figura S1, F1) AMI). E resultadonan aki a wòrdu konfirmá dor di usa métodonan di siñamentu di mashin pa asigná fenotiponan di cel outomatikamente (21), ku a revelá mas aleu e presensia di un kantidat grandi di cel di medula di wesu (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) den e ascites di e pashènt (Figura S2A ). Entre tur e tiponan di cel identifiká, e poblashon di cel mieloide aki a mustra e absorshon di glukosa i aktividat mitokondrial mas haltu (Figura S2, B pa G). E resultadonan aki ta destaká e diferensianan metabóliko fuerte entre e tiponan di sèl múltiple hañá den ascites i tumornan den pashèntnan di HGSC.
E reto prinsipal pa komprondé e karakterístikanan metabonómiko di TIL ta e nesesidat pa isolá muestranan di sèl T di sufisiente puresa, kalidat i kantidat for di tumornan. Estudionan resien a mustra ku métodonan di sorteo i enrikesimentu di grano basá riba sitometria di fluho por kondusí na kambionan den e profilnan di metabolito selular (22-24). Pa superá e problema aki, nos a optimalisá e método di enrikesimentu di kralchi pa isolá i isolá TIL for di kanser di ovario humano resektá kirúrgikamente promé ku analisis pa medio di LC-MS/MS (wak Material i Métodonan; Figura 2A). Pa por evaluá e impakto general di e protokòl aki riba kambionan di metabolito, nos a kompará e profilnan di metabolito di celnan T aktivá pa donantenan saludabel despues di e paso di separashon di grano ariba menshoná ku celnan ku no tabata separá di grano pero a keda riba ijs. E analisis di kòntròl di kalidat aki a haña ku tin un korelashon haltu entre e dos kondishonnan aki (r = 0.77), i e ripitibilidat tékniko di e grupo di 86 metabolito tin ripitibilidat haltu (Figura 2B). P’esei, e métodonan aki por hasi analisis di metabolito eksakto den celnan ku ta pasando den enrikesimentu di tipo di cel, proveyendo asina e promé plataforma di resolushon haltu pa identifiká metabolitonan spesífiko den HGSC, permitiendo asina hende haña un komprondementu mas profundo di spesifisidat di cel Programa di metabolismo seksual.
(A) Diagram skemátiko di enrikesimentu di perla magnétiko. Promé ku analisis pa LC-MS/MS, e sèlnan lo pasa dor di tres rònt konsekutivo di enrikesimentu di grano magnétiko òf lo keda riba ijs. (B) E efekto di tipo di enrikesimentu riba e abundansia di metabolitonan. E promedio di tres midimentu pa kada tipo di enrikesimentu ± SE. E liña gris ta representá un relashon 1:1. E korelashon intra-klase (ICC) di midimentunan ripití ta mustra den e etiketa di e as. NAD, nikotinamida adenina dinukleotida. (C) Diagram skemátiko di e fluho di trabou di analisis di metabolito di pashènt. Ascites òf tumornan ta wòrdu rekohé for di pashèntnan i ta wòrdu kriokonservá. Un parti chikitu di kada muestra a wòrdu analisá pa medio di sitometria di fluho, miéntras ku e muestranan ku a sobra a pasa den tres rònt di enrikesimentu pa CD4+, CD8+ i CD45- celnan. E frakshonnan di cel aki a wòrdu analisá usando LC-MS/MS. (D) Mapa di kalor di abundansia di metabolito standardisá. E dendrogram ta representá Ward su agrupashon di distansianan euklidiano entre muestranan. (E) Análisis di komponente prinsipal (PCA) di mapa di metabolito di muestra, mustrando tres replika di kada muestra, muestranan di e mesun pashènt ta konektá pa un liña. (F) E PCA di e profil di metabolito di e muestra kondishoná riba e pashènt (es desir, usando redundansia parsial); e tipo di muestra ta limitá pa e kaska konvekso. PC1, komponente prinsipal 1; PC2, komponente prinsipal 2.
Siguientemente, nos a apliká e método di enrikesimentu aki pa analisá 99 metabolito den e frakshonnan di sèl CD4 +, CD8 + i CD45 den e ascites i tumornan primario di seis pashènt di HGSC (Figura 2C, Figura S3A i Tabel S3 i S4). E poblashon di interes ta konta pa 2% pa 70% di e muestra grandi original di celnan bibu, i e proporshon di celnan ta varia grandemente entre pashèntnan. Despues di separá e bòternan, e frakshon di interes enrikesé (CD4+, CD8+ òf CD45-) ta konta pa mas ku 85% di tur sèl bibu den e muestra promedio. E método di enrikesimentu aki ta permití nos analisá poblashonnan di cel for di metabolismo di tehido di tumor humano, loke ta imposibel pa hasi for di muestranan grandi. Usando e protokòl aki, nos a determiná ku l-kynurenine i adenosina, e dos metabolitonan imunosupresivo bon karakterisá aki tabata elevá den celnan T di tumor òf celnan di tumor (Figura S3, B i C). P’esei, e resultadonan aki ta demostrá e fieldat i abilidat di nos teknologia di separashon di cel i spektrometria di masa pa haña metabolitonan biológikamente importante den e tehidonan di pashènt.
Nos analisis tambe a revelá un separashon metabóliko fuerte di tiponan di sèl denter i entre pashèntnan (Figura 2D i Figura S4A). En partikular, kompará ku otro pashèntnan, pashènt 70 a mustra diferente karakterístika metabóliko (Figura 2E i Figura S4B), indikando ku por tin heterogeneidat metabóliko supstansial entre pashèntnan. Ta bon pa menshoná ku kompará ku otro pashèntnan (1.2 pa 2 liter; Tabel S1), e kantidat total di ascites rekohé den pashènt 70 (80 ml) tabata mas chikitu. E kòntròl di heterogeneidat inter-pashènt durante analisis di komponente prinsipal (por ehèmpel, usando analisis di redundansia parsial) ta mustra kambionan konsistente entre tiponan di cel, i e tiponan di cel i/òf mikroambiente ta wòrdu agregá klaramente segun e profil di metabolito (Figura 2F ). E analisis di metabolitonan individual a enfatisá e efektonan aki i a revelá diferensianan signifikante entre tiponan di cel i mikroambiente. Ta bon pa menshoná ku e diferensia mas ekstremo opservá ta MNA, ku ta wòrdu enrikesé normalmente den celnan CD45- i den celnan CD4+ i CD8+ ku ta infiltrá e tumor (Figura 3A). Pa celnan CD4 +, e efekto aki ta mas opvio, i e MNA den celnan CD8 + tambe ta parse di ta fuertemente afektá pa e medio ambiente. Sinembargo, esaki no ta importante, pasobra solamente tres di e seis pashèntnan por wòrdu evaluá pa e skornan di CD8+ di tumor. Ademas di MNA, den diferente tipo di sèl den ascites i tumor, otro metabolitonan ku ta mal karakterisá den TIL tambe ta diferensialmente riku (Figuranan S3 i S4). P’esei, e datonan aki ta revelá un sèt prometedor di metabolitonan imunomodulador pa mas investigashon.
(A) Kontenido normalisá di MNA den celnan CD4+, CD8+ i CD45- for di ascites i tumor. E gráfiko di kuadro ta mustra e mediano (liña), e rango interkuartil (frame hinge) i e rango di dato, te ku 1.5 biaha e rango interkuartil (frame whisker). Manera deskribí den Material i Métodonan di Pashènt, usa e balor di limma di e pashènt pa determiná e balor di P (*P<0.05 i **P<0.01). (B) Diagram skemátiko di metabolismo di MNA (60). Metabolitonan: S-adenosyl-1-metionine; SAH, S-adenosina-1-homosisteina; NA, nikotinamida; MNA, 1-metilnikotinamida; 2-PY, 1-metil- 2-piridona-5-karboksamida; 4-PY, 1-metil-4-piridona-5-karboksamida; NR, nikotinamida ribosa; NMN, mononukleotido di nikotinamida. Enzimanan (bèrdè): NNMT, nikotinamida N-metiltransferasa; SIRT, sirtuins; NAMPT, nikotinamida fosforibosil transferasa; AOX1, aldehido oxidase 1; NRK, nicotinamide riboside kinase; NMNAT, nicotinamide mono Nucleotide adenylate transferase; Pnp1, fosforilasa di nukleosida di purina. (C) t-SNE di scRNA-seq di ascites (grijs) i tumor (kòrá; n = 3 pashènt). (D) Ekspreshon di NNMT den diferente poblashon di cel identifiká usando scRNA-seq. (E) Ekspreshon di NNMT i AOX1 den SK-OV-3, nir embrionario humano (HEK) 293T, sèlnan T i sèlnan T tratá ku MNA. E ekspreshon doblá ta wòrdu mustra relashoná ku SK-OV-3. E patronchi di ekspreshon ku SEM ta wòrdu mustra (n = 6 donante saludabel). Balornan di Ct mas grandi ku 35 ta wòrdu konsiderá indetectabel (UD). (F) Ekspreshon di SLC22A1 i SLC22A2 den SK-OV-3, HEK293T, sèlnan T i sèlnan T tratá ku 8mM MNA. E ekspreshon doblá ta wòrdu mustra relashoná ku SK-OV-3. E patronchi di ekspreshon ku SEM ta wòrdu mustra (n = 6 donante saludabel). Balornan di Ct mas grandi ku 35 ta wòrdu konsiderá indetectabel (UD). (G) Kontenido di MNA di cel den celnan T di donante saludabel aktivá despues di 72 ora di inkubashon ku MNA. E patronchi di ekspreshon ku SEM ta wòrdu mustra (n = 4 donante saludabel).
MNA ta wòrdu produsí dor di transferí e grupo metil di S-adenosyl-1-metionine (SAM) pa nicotinamide (NA) dor di nicotinamide N-metiltransferase (NNMT; Figura 3B). NNMT ta wòrdu sobreekspresá den un variedat di kanser humano i ta asosiá ku proliferashon, invashon i metástasis (25-27). Pa komprondé mihó e fuente di MNA den celnan T den TME, nos a usa scRNA-seq pa karakterisá e ekspreshon di NNMT den tiponan di cel den e ascites i tumornan di tres pashènt di HGSC (Tabela S5). Análisis di aproksimadamente 6.500 sèl a mustra ku den ambientenan di ascites i tumor, ekspreshon di NNMT tabata restringí na e presunto poblashonnan di sèl di fibroblast i tumor (Figura 3, C i D). Ta bon pa menshoná ku no tin ekspreshon opvio di NNMT den ningun poblashon ku ta ekspresá PTPRC (CD45 +) (Figura 3D i Figura S5A), loke ta indiká ku e MNA detektá den e spektrum di metabolito a wòrdu introdusí den celnan T. E ekspreshon di aldehido oxidase 1 (AOX1) ta kombertí MNA den 1-metil-2-piridona-5-karboksamida (2-PYR) òf 1-metil-4-piridona-5-karboksamida (4-PYR); Figura 3B) tambe ta restringí na e poblashon di fibroblastnan ku ta ekspresá COL1A1 (Figura S5A), ku huntu ta indiká ku sèlnan T no tin e abilidat di metabolismo konvenshonal di MNA. E patronchi di ekspreshon di e genenan relashoná ku MNA aki a wòrdu verifiká usando un di dos sèt di dato di cel independiente for di ascites di pashèntnan di HGSC (Figura S5B; n = 6) (16). Ademas, e analisis kuantitativo di reakshon di kadena di polimerasa (qPCR) di celnan T di donante saludabel tratá ku MNA a mustra ku kompará ku celnan di tumor di ovario SK-OV-3 di kòntròl, NNMT òf AOX1 kasi no tabata ekspresá (Figura 3E). E resultadonan inesperá aki ta indiká ku MNA por wòrdu sekretá for di fibroblast òf tumor den sèlnan T besindario den TME.
Aunke kandidatonan ta inkluí e famia di transportadónan di kation orgániko 1 pa 3 (OCT1, OCT2 i OCT3) kodifiká pa e famia di portadó solubel 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 i SLC22A3), e transportadónan potensial di MNA ainda no ta definí (28) . QPCR di mRNA di celnan T di donante saludabel a mustra nivelnan abou di ekspreshon di SLC22A1 pero nivelnan indetectabel di SLC22A2, loke a konfirmá ku el a wòrdu raportá anteriormente den literatura (Figura 3F) (29). Na kontraste, e liña di cel di tumor di ovario SK-OV-3 a ekspresá nivelnan haltu di tur dos transportadó (Figura 3F).
Pa por tèst e posibilidat ku sèlnan T tin e abilidat pa apsorbé MNA stranhero, sèlnan T di donante saludabel a wòrdu kultivá pa 72 ora den presensia di diferente konsentrashon di MNA. Den ousensia di MNA eksógeno, e kontenido selular di MNA no por wòrdu detektá (Figura 3G). Sinembargo, sèlnan T aktivá tratá ku MNA eksógeno a mustra un oumento dependiente di dosis den kontenido di MNA den e sèlnan, te ku 6 mM MNA (Figura 3G). E resultado aki ta indiká ku apesar di e nivel abou di ekspreshon di transportadó i falta di e enzima prinsipal responsabel pa metabolismo di MNA intraselular, TIL por tuma MNA ainda.
E spektrum di metabolitonan den e sèlnan T di pashèntnan i eksperimentonan di absorshon di MNA in vitro ta oumentá e posibilidat ku fibroblastonan asosiá ku kanser (CAF) ta sekretá MNA i sèlnan di tumor por regulá e fenotipo i funshon di TIL. Pa determiná e efekto di MNA riba celnan T, celnan T di donante saludabel a wòrdu aktivá in vitro den presensia òf ousensia di MNA, i nan proliferashon i produkshon di sitokina a wòrdu evaluá. Despues di 7 dia di agregá MNA na e dosis mas haltu, e kantidat di redoblashon di poblashon a wòrdu redusí moderadamente, miéntras ku e vigor a keda mantené na tur dosis (Figura 4A). Ademas, tratamentu di MNA eksógeno a resultá den un oumento den e proporshon di celnan T CD4 + i CD8 + ku ta ekspresá faktor di nekrosis di tumor-α (TNFα; Figura 4B). Na kontraste, e produkshon intraselular di IFN-γ tabata signifikantemente redusí den CD4 + T celnan, pero no den CD8 + T celnan, i no tabatin kambio signifikante den interleukin 2 (IL-2; Figura 4, C i D). P’esei, e ensayo di imunosorbente ligá na enzima (ELISA) di supernatantenan di e kulturanan di sèl T tratá ku MNA aki a mustra un oumento signifikante den TNFα, un bahada den IFN-γ, i no kambio den IL-2 (Figura 4, E pa G). . E bahada di IFN-γ ta indiká ku MNA por hunga un ròl den inhibishon di e aktividat anti-tumor di celnan T. Pa por simulá e efekto di MNA riba sitotoksisidat media pa sèl T, sèlnan T di reseptor di antigeno kimériko (FRα-CAR-T) ku ta dirigí riba reseptor di folat α i sèlnan CAR-T (GFP) regulá pa sèlnan di proteina fluoresente bèrdè (GFP) -CAR-T) ta wòrdu produsí pa sèlnan mononuklear di sanger perifériko di donante saludabel (PBMC). CAR-T celnan a wòrdu kultivá pa 24 ora den presensia di MNA, i despues ko-kultivá ku celnan di tumor di ovario SK-OV-3 humano ku ta ekspresá reseptor di folato α na un relashon di efektor pa meta di 10:1. Tratamentu ku MNA a resultá den un bahada signifikante den e aktividat di matamentu di celnan FRα-CAR-T, ku tabata similar na celnan FRα-CAR-T tratá ku adenosina (Figura 4H).
(A) Total di kantidat di sèl viabel i redoblashon di poblashon (PD) direktamente for di kultura riba dia 7. E grafiko di bara ta representá e promedio + SEM di seis donante saludabel. Ta representá datonan di por lo ménos n = 3 eksperimento independiente. (B pa D) CD3/CD28 i IL-2 a wòrdu usá pa aktivá celnan T na nan respektivo konsentrashonnan di MNA pa 7 dia. Promé ku e analisis, e sèlnan a wòrdu stimulá ku PMA/ionomycin ku GolgiStop pa 4 ora. Ekspreshon di TNFα (B) den celnan T. Imágen di ehèmpel (na robes) i datonan tabular (na drechi) di ekspreshon di TNFα den celnan bibu. Ekspreshon di IFN-γ (C) i IL-2 (D) den celnan T. E ekspreshon di sitokina a wòrdu midi pa medio di sitometria di fluho. E grafiko di bar ta representá e promedio (n = 6 donante saludabel) + SEM. Usa analisis di variashon di un solo kaminda i midimentunan ripití (*P<0.05 i **P<0.01) pa determiná e balor di P. Ta representá datonan di por lo ménos n = 3 eksperimento independiente. (E pa G) CD3/CD28 i IL-2 a wòrdu usá pa aktivá celnan T na nan respektivo konsentrashonnan di MNA pa 7 dia. E medio a wòrdu rekohé promé i despues di 4 ora di stimulashon di PMA/ionomycin. E konsentrashonnan di TNFα (E), IFN-γ (F) i IL-2 (G) a wòrdu midi pa medio di ELISA. E grafiko di bara ta representá e promedio (n = 5 donante saludabel) + SEM. Balor di P determiná usando analisis di variashon di un solo kaminda i midimentunan ripití (*P<0.05). E liña punteá ta indiká e límite di detekshon di e detekshon. (H) Ensayo di lisis di cel. E sèlnan FRα-CAR-T òf GFP-CAR-T a wòrdu ahusta ku adenosina (250μM) òf MNA (10 mM) pa 24 ora, òf a keda sin wòrdu tratá (Ctrl). E porsentahe di matamentu di celnan SK-OV-3 a wòrdu midi. P value determiná pa Welch t test (*P<0.5 i **P<0.01).
Pa por haña un komprondementu mekanistiko di regulashon di ekspreshon di TNFα dependiente di MNA, e kambionan den TNFα mRNA di celnan T tratá ku MNA a wòrdu evaluá (Figura 5A). Sèlnan T di donante saludabel tratá ku MNA a mustra un oumento di dos biaha den e nivelnan di transkripshon di TNFα, indikando ku MNA ta dependiente di regulashon di transkripshon di TNFα. Pa investigá e posibel mekanismo regulatorio aki, dos faktor di transkripshon konosí ku ta regulá TNFα, esta faktor nuklear di sèl T aktivá (NFAT) i proteina spesífiko 1 (Sp1), a wòrdu evaluá komo kontesta na unimentu di MNA na e promotor proksimal di TNFα ( 30). E promotor di TNFα ta kontené 6 sitio di unimentu di NFAT identifiká i 2 sitio di unimentu di Sp1, ku ta overlap na un sitio [-55 par di base (bp) for di e 5’cap] (30). Imunopresipitashon di kromatina (ChIP) a mustra ku ora a wòrdu tratá ku MNA, e unimentu di Sp1 na e promotor di TNFα a oumentá tres biaha. E inkorporashon di NFAT tambe a oumentá i a aserka importansia (Figura 5B). E datonan aki ta indiká ku MNA ta regulá e ekspreshon di TNFα a traves di transkripshon di Sp1, i na un grado ménos e ekspreshon di NFAT.
(A) Kompará ku celnan T kultivá sin MNA, e kambio di ekspreshon di TNFα den celnan T tratá ku MNA. E patronchi di ekspreshon ku SEM ta wòrdu mustra (n = 5 donante saludabel). Ta representá datonan di por lo ménos n = 3 eksperimento independiente. (B) E promotor TNFα di celnan T tratá ku òf sin 8 mM MNA despues ku NFAT i Sp1 a wòrdu kombiná ku (Ctrl) i stimulashon di PMA/ionomycin pa 4 ora. Imunoglobulin G (IgG) i H3 a wòrdu usá komo kòntròlnan negativo i positivo pa imunopresipitashon, respektivamente. E kuantifikashon di ChIP a mustra ku e unimentu di Sp1 i NFAT na e promotor di TNFα den celnan tratá ku MNA a oumentá vários biaha kompará ku e kòntròl. Ta representá datonan di por lo ménos n = 3 eksperimento independiente. Balor di P determiná pa múltiple t-test (*** P <0.01). (C) Kompará ku e ascites di HGSC, celnan T (no-sitotóksiko) a mustra oumento di ekspreshon di TNF den e tumor. E koló ta representá diferente pashènt. E sèlnan mustra a wòrdu samplá aleatoriamente na 300 i jittered pa limitá overdrawing (** Padj = 0.0076). (D) Modelo proponé di MNA pa kanser di ovario. MNA ta wòrdu produsí den celnan di tumor i fibroblastnan den TME i ta wòrdu tuma dor di celnan T. MNA ta oumentá e union di Sp1 na e promotor di TNFα, loke ta kondusí na oumento di transkripshon di TNFα i produkshon di sitokina di TNFα. MNA tambe ta kousa un bahada den IFN-γ. Inhibishon di funshon di sèl T ta kondusí na abilidat di matamentu redusí i kresementu di tumor aselerá.
Di akuerdo ku informenan, TNFα tin efektonan anti-tumor i anti-tumor dependiente dilanti i patras, pero e tin un ròl konosí den promové e kresementu i metástasis di kanser di ovario (31-33). Di akuerdo ku informenan, e konsentrashon di TNFα den ascites i tehidonan di tumor den pashèntnan ku kanser di ovario ta mas haltu ku esun den tehidonan benigno (34-36). Pa loke ta trata mekanismo, TNFα por regulá e aktivashon, funshon i proliferashon di celnan blanku di sanger, i kambia e fenotipo di celnan di kanser (37, 38). Konsistente ku e resultadonan aki, e analisis di ekspreshon di gene diferensial a mustra ku TNF tabata signifikantemente up-regulá den celnan T den tehidonan di tumor kompará ku ascites (Figura 5C). E oumento den ekspreshon di TNF tabata solamente evidente den poblashonnan di sèl T ku un fenotipo no-sitotóksiko (Figura S5A). Den resumen, e datonan aki ta sostené e punto di bista ku MNA tin efektonan dobel imunosupresivo i promotor di tumor den HGSC.
Etiketahe fluoresente basá riba sitometria di fluho a bira e método prinsipal pa studia metabolismo di TIL. E estudionan aki a mustra ku kompará ku linfositonan di sanger perifériko òf sèlnan T di órganonan linfoide sekundario, TIL di raton i humano tin un tendensia mas haltu pa tuma glukosa (4, 39) i e pèrdida gradual di funshon mitokondrial (19, 40). Aunke nos a opservá resultadonan similar den e estudio aki, e desaroyo klave ta pa kompará e metabolismo di celnan di tumor i TIL for di e mesun tehido di tumor resektá. Konsistente ku algun di e informenan anterior aki, sèlnan di tumor (CD45-EpCAM +) for di ascites i tumornan tin un kaptamentu di glukosa mas haltu ku sèlnan T CD8 + i CD4 +, loke ta sostené ku e kaptamentu haltu di glukosa di sèlnan di tumor por wòrdu kompará ku sèlnan T. E konsepto di kompetensia di sèl T. TME. Sinembargo, e aktividat mitokondrial di celnan di tumor ta mas haltu ku esun di celnan CD8 + T, pero e aktividat mitokondrial ta similar na esun di celnan CD4 + T. E resultadonan aki ta reforsá e tema emergente ku metabolismo oxidativo ta importante pa celnan di tumor (41, 42). Nan ta sugerí tambe ku e sèlnan CD8 + T por ta mas suseptibel na disfunshon oksidativo ku e sèlnan CD4 + T, òf ku e sèlnan CD4 + T por usa fuentenan di karbon ku no ta glukosa pa mantené aktividat mitokondrial (43, 44). Mester tuma nota ku nos no a opservá diferensia den e absorshon di glukosa òf aktividat mitokondria entre efektornan CD4 + T, memoria di efektor T i celnan di memoria sentral T den ascites. Di mes manera, e estado di diferensiashon di CD8 + T celnan den tumornan no tin nada di haber ku kambionan den e kaptamentu di glukosa, resaltando e diferensia signifikante entre T celnan kultivá in vitro i TIL humano in vivo (22). E opservashonnan aki tambe a wòrdu konfirmá dor di e uso di alokashon di poblashon di cel outomatiko imparsial, ku a revelá mas aleu ku celnan CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + ku un absorshon di glukosa i aktividat mitokondrial mas haltu ku celnan di tumor ta prevalente pero tin un poblashon di cel aktivo Metabóliko. E poblashon aki por representá e subpoblashon putativo di celnan supresor mieloide òf celnan dendrítiko plasmasitoide identifiká den e analisis di scRNA-seq. Aunke tur dos di esakinan a wòrdu raportá den tumornan di ovario humano [45], nan mester ainda Mas trabou ta pa deskribí e subpoblashon mieloide aki.
Aunke métodonan basá riba sitometria di fluho por aklará e diferensianan general den glukosa i metabolismo oxidativo entre tiponan di cel, e metabolitonan presis produsí pa glukosa òf otro fuentenan di karbon pa metabolismo mitokondrial den TME no a wòrdu determiná ainda. Asigná e presensia òf ousensia di metabolitonan na un supkonhunto di TIL duná ta rekerí purifikashon di e poblashon di cel for di e tehido eksisi. P’esei, nos método di enrikesimentu di cel kombiná ku spektrometria di masa por duna bista riba e metabolitonan ku ta enrikesé diferensialmente den poblashonnan di celnan T i celnan di tumor den muestranan di pashènt ku ta kuadra. Aunke e método aki tin bentahanan riba sorteo di celnan aktivá pa fluorescencia, sierto bibliotekanan di metabolito por wòrdu afektá debí na stabilidat inherente i/òf tasa di rotashon rápido (22). Sinembargo, nos método por a identifiká dos metabolito imunosupresivo rekonosé, adenosina i kynurenina, pasobra nan ta varia hopi entre tiponan di muestra.
Nos analisis metabonómiko di tumornan i subtiponan di TIL ta duna mas bista riba e ròl di metabolitonan den TME di ovario. Promé, usando sitometria di fluho, nos a determiná ku no tabatin diferensia den aktividat mitokondrial entre tumornan i sèlnan CD4 + T. Sinembargo, e analisis di LC-MS/MS a revelá kambionan signifikante den e abundansia di metabolitonan bou di e poblashonnan aki, indikando ku konklushonnan tokante metabolismo di TIL i su aktividat metabóliko en general ta rekerí interpretashon kuidadoso. Na di dos lugá, MNA ta e metabolito ku e diferensia mas grandi entre CD45-selnan i T-selnan den ascites, no tumornan. P’esei, kompartimentashon i lokalidat di tumor por tin diferente efekto riba metabolismo di TIL, loke ta destaká e posibel heterogenidat den un mikroambiente duná. Di tres, e ekspreshon di e enzima ku ta produsí MNA NNMT ta limitá prinsipalmente na CAF, ku ta sèlnan di tumor na un grado ménos, pero nivelnan di MNA detektabel ta wòrdu opservá den sèlnan T derivá di tumor. E sobreekspreshon di NNMT den CAF di ovario tin un efekto konosí ku ta promové kanser, parsialmente debí na e promoshon di metabolismo di CAF, invashon di tumor i metástasis (27). Aunke e nivel general di TIL ta moderá, e ekspreshon di NNMT den CAF ta estrechamente relashoná ku e subtipo mesenkimal di Cancer Genome Atlas (TCGA), ku ta asosiá ku mal pronóstiko (27, 46, 47). Finalmente, e ekspreshon di e enzima AOX1 responsabel pa degradashon di MNA tambe ta limitá na e poblashon di CAF, loke ta indiká ku e sèlnan T no tin e abilidat pa metabolisá MNA. E resultadonan aki ta sostené e idea ku ounke mas trabou ta nesesario pa verifiká e resultado aki, nivelnan haltu di MNA den celnan T por indiká e presensia di un mikroambiente CAF imunosupresivo.
Konsiderando e nivel abou di ekspreshon di transportadónan di MNA i e nivelnan indetectabel di proteinanan klave enbolbí den metabolismo di MNA, e presensia di MNA den celnan T ta inesperá. Ni NNMT ni AOX1 por a wòrdu detektá dor di analisis di scRNA-seq i qPCR dirigí di dos kohort independiente. E resultadonan aki ta indiká ku MNA no ta wòrdu sintetisá pa celnan T, pero ta wòrdu apsorbé for di TME rònt di dje. Eksperimentunan in vitro ta mustra ku sèlnan T tin e tendensia di akumulá MNA eksógeno.
Nos estudionan in vitro a mustra ku MNA eksógeno ta indusí e ekspreshon di TNFα den celnan T i ta mehorá e unimentu di Sp1 na e promotor di TNFα. Aunke TNFα tin tantu funshonnan anti-tumor komo anti-tumor, den kanser di ovario, TNFα por promové e kresementu di kanser di ovario (31-33). E neutralisashon di TNFα den kultura di cel di tumor di ovario òf e eliminashon di señal di TNFα den modelonan di raton por mehorá produkshon di sitokina inflamatorio media pa TNFα i inhibi kresementu di tumor (32, 35). P’esei, den e kaso aki, MNA derivá di TME por fungi komo un metabolito pro-inflamatorio a traves di un mekanismo dependiente di TNFα a traves di e buèlta outokrin, promoviendo asina e aparishon i plamamentu di kanser di ovario (31). A base di e posibilidat aki, blokeo di TNFα ta wòrdu studia komo un agente terapéutiko potensial pa kanser di ovario (37, 48, 49). Ademas, MNA ta afektá e sitotoksisidat di celnan CAR-T pa celnan di tumor di ovario, dunando mas evidensia pa supreshon inmunológiko media pa MNA. Kolektivamente, e resultadonan aki ta sugerí un modelo den kua tumornan i celnan di CAF ta sekretá MNA den TME ekstraselular. Pa medio di (i) stimulashon di kresementu di kanser di ovario indusí pa TNF i (ii) inhibishon di aktividat sitotóksiko di sèl T indusí pa MNA, esaki por tin un efekto di tumor dobel (Figura 5D).
Den konklushon, dor di apliká un kombinashon di enrikesimentu rápido di cel, sekuensiamentu di cel individual i profilashon metabóliko, e estudio aki a revelá e diferensianan imunometabóliko grandi entre tumor i celnan di ascites den pashèntnan di HGSC. E analisis amplio aki a mustra ku tin diferensianan den e absorshon di glukosa i aktividat mitokondria entre celnan T, i a identifiká MNA komo un metabolito regulatorio inmune outónomo no-selular. E datonan aki tin un impakto riba kon TME ta afektá metabolismo di sèl T den kansernan humano. Aunke e kompetensia direkto pa nutrientenan entre celnan T i celnan di kanser a wòrdu raportá, metabolitonan por fungi tambe komo reguladornan indirekto pa promové progreso di tumor i posiblemente suprimí kontesta inmunológiko endógeno. E deskripshon mas aleu di e ròl funshonal di e metabolitonan regulatorio aki por habri strategianan alternativo pa mehorá e kontesta inmune anti-tumor.
E ehèmpelnan di pashènt i datonan klíniko a wòrdu optené a traves di e repositorio di tehido di tumor di kanser di BC sertifiká pa e Red di Repositorio di Tehido di Canada. Di akuerdo ku e protokòl aprobá pa e Komité di Étika di Investigashon di Kanser di BC i e Universidat di British Columbia (H07-00463), tur e ehemplarnan di pashènt i datonan klíniko a optené konsentimentu por eskrito informá òf a renunsiá nan konsentimentu formalmente. E muestranan ta wòrdu wardá den e BioBank sertifiká (BRC-00290). Karakterístika detayá di pashènt ta wòrdu mustra den Tabelnan S1 i S5. Pa kriopreservashon, un bisturí ta wòrdu usá pa deskomponé mekanikamente e muestra di tumor di e pashènt i despues push’é dor di un filter di 100 mikron pa optené un suspenshon di un solo sèl. E ascites di e pashènt a wòrdu sentrifugá na 1500 rpm pa 10 minüt na 4°C pa pellet e celnan i kita e supernatante. Celnan optené for di tumor i ascites a wòrdu kriokonservá den 50% di serum AB humano inaktivá pa kalor (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) i 10% dimetil sulfóksido. E suspenshonnan di sèl individual konserbá aki a wòrdu deskongelá i usá pa metabolomika i determinashon di metabolito deskribí mas abou.
E medio kompleto ta konsistí di 0.22 μm filtrá 50:50 suplementá RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) suplementá ku 10% suero AB humano inaktivá pa kalor (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) x1 Solushon di Penisilin Streptomisina (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) i 50 μMB-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) ta wòrdu suplementá ku 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) i 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). E tampón di manchamentu di sitometer di fluho tabata konsistí di 0.22μm di salina tampón di fosfato filtrá (PBS; Invitrogen) suplementá ku 3% di suero humano AB inaktivá pa kalor (Sigma). E buffer di enrikesimentu di cel ta komponé di 0.22μm PBS filtrá i suplementá ku 0.5% di suero AB humano inaktivá pa kalor (Sigma-Aldrich).
Den un medio kompleto di 37°C, e sèlnan a wòrdu mancha ku 10 nM MT DR i 100 μM 2-NBDG pa 30 minüt. Siguientemente, e sèlnan a wòrdu mancha ku e tint di viabilidat eF506 na 4°C pa 15 minüt. Resuspendé e sèlnan den FC Block (eBioscience) i Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), diluí den flow cytometer staining buffer (di akuerdo ku e instrukshonnan di e fabrikante), i inkubá pa 10 minüt na temperatura di kamber. Mancha e sèlnan ku un sèt di antikurpa (Tabela S2) den buffer di manchamentu di sitometria di fluho na 4°C pa 20 minüt. Resuspendé e sèlnan den buffer di manchamentu di sitometria di fluho (Cytek Aurora; konfigurashon 3L-16V-14B-8R) promé ku analisis. Usa SpectroFlo i FlowJo V10 pa analisá datonan di kantidat di cel, i usa GraphPad Prism 8 pa krea e datonan. E intensidat di fluorescencia mediano (MFI) di 2-NBDG i MT DR a wòrdu log-normalisá, i despues a usa un tèst di t pareá pa analisis estadístiko pa duna kuenta di pashèntnan parehá. Kita tur poblashon ku ménos ku 40 evento for di e analisis; introdusí un balor di MFI di 1 pa kualke balor negativo promé ku hasi analisis estadístiko i visualisashon di dato.
Pa por suplementá e strategia di gating manual di e panel di proseso ariba menshoná, nos a usa e anotashon kompletu dor di e palu di restrikshon di forma (FAUST) (21) pa asigná sèlnan outomatikamente na e poblashon despues di a eliminá sèlnan morto den FlowJo. Nos ta manehá e output manualmente pa kombiná poblashonnan ku ta parse di ta mal aloká (kombinando PD1+ ku sèlnan di tumor PD1) i poblashonnan retené. Kada muestra ta kontené un promedio di mas ku 2% di sèl, pa un total di 11 poblashon.
Sentrifugashon di densidat di gradiente di Ficoll a wòrdu usá pa separá PBMC for di produktonan di separashon di leukosito (STEMCELL Technologies). CD8 + T cells a wòrdu isolá for di PBMC usando CD8 MicroBeads (Miltenyi) i ekspandé den medio kompleto usando TransAct (Miltenyi) pa 2 siman segun e instrukshonnan di e fabrikante. E sèlnan a wòrdu permití para pa 5 dia den un medio kompleto ku ta kontené IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), i despues a wòrdu re-stimulá ku TransAct. Riba dia 7, segun e instrukshonnan di e fabrikante, a usa CD45 MicroBeads humano (Miltenyi) pa enrikesé sèlnan den tres rònt konsekutivo. E sèlnan a wòrdu alikuotá pa analisis di sitometria di fluho (manera deskribí ariba), i un mion sèl a wòrdu alikuotá tres biaha pa analisis di LC-MS/MS. E muestranan a wòrdu prosesá pa LC-MS/MS manera deskribí mas abou. Nos a kalkulá e balor di metabolito ku falta ku un kantidat di ion di 1.000. Kada muestra ta wòrdu normalisá pa e kantidat di ion total (TIC), kombertí logaritmikamente i normalisá outomatikamente den MetaboAnalystR promé ku analisis.
E suspenshon di sèl individual di kada pashènt a wòrdu deskongelá i filtrá a traves di un filter di 40 μm den un medio kompleto (manera deskribí ariba). Di akuerdo ku e protokòl di e fabrikante, tres rònt konsekutivo di selekshon positivo dor di separashon di grano magnétiko usando MicroBeads (Miltenyi) a wòrdu usá pa enrikesé e muestranan pa CD8+, CD4+ i CD45- sèlnan (riba ijs). Den kòrtiku, e sèlnan ta wòrdu resuspendé den buffer di enrikesimentu di sèl (manera deskribí ariba) i ta wòrdu kontá. E sèlnan a wòrdu inkubá ku CD8 humano, CD4 humano òf CD45 humano (Miltenyi) na 4°C pa 15 minüt, i despues a wòrdu labá ku buffer di enrikesimentu di cel. E muestra ta wòrdu pasá dor di e kolumna LS (Miltenyi), i e frakshonnan positivo i negativo ta wòrdu rekohé. Pa por redusí e durashon i maksimisá e paso di rekuperashon di cel, e CD8-frakshon ta wòrdu usá despues pa e di dos buèlta di enrikesimentu di CD4+, i e CD4-frakshon ta wòrdu usá pa e CD45-enrikesimentu siguiente. Tene e solushon riba ijs durante henter e proseso di separashon.
Pa prepará muestranan pa analisis di metabolito, e sèlnan a wòrdu labá un biaha ku solushon di salu friu manera ijs, i 1 ml di 80% di metanol a wòrdu agregá na kada muestra, despues a wòrdu vorteks i snap freeze den nitrogeno líkido. E muestranan a wòrdu sometí na tres siklo di vries-thaw i sentrifugá na 14.000 rpm pa 15 minüt na 4°C. E supernatante ku ta kontené e metabolitonan ta wòrdu evaporá te ora e seku. E metabolitonan a wòrdu re-disolvé den 50 μl di 0.03% di asido fórmiko, vortex pa meskla, i despues sentrifugá pa kita debris.
Saka metabolitonan manera deskribí ariba. Transferí e supernatante pa un bòter di kromatografia di líkido di haltu rendimentu pa investigashon di metabolomika. Usa un protokòl di tratamentu aleatorio pa trata kada muestra ku un kantidat similar di sèl pa prevení efektonan di lote. Nos a hasi un evaluashon kualitativo di metabolitonan global publiká anteriormente riba e AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Análisis kromatográfiko i integrashon di área di punta a wòrdu realisá usando e software MultiQuant vershon 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Un kantidat di ion di 1000 a wòrdu usá pa kalkulá e balor di metabolito ku falta, i e TIC di kada muestra a wòrdu usá pa kalkulá e área di pik normalisá di kada metabolito detektá pa koregí pa kambionan introdusí dor di e analisis instrumental for di prosesamentu di muestra. Despues ku TIC ta normalisá, MetaboAnalystR(51) (parameter predeterminá) ta wòrdu usá pa kombershon logaritmiko i eskalashon di liña di norma outomátiko. Nos a usa PCA ku pakete R vegano pa hasi analisis eksploratorio di diferensianan di metaboloma entre tiponan di muestra, i a usa analisis di redundansia parsial pa analisá pashèntnan. Usa e método di Ward pa konstruí un dendrogram di mapa di kalor pa agrupá e distansia euklidiano entre e muestranan. Nos a usa limma (52) riba abundansia di metabolito standardisá pa identifiká metabolitonan diferensialmente abundante den henter e tipo di sèl i mikroambiente. Pa por simplifiká e splikashon, nos ta usa e parameter di promedio di grupo pa spesifiká e modelo, i konsiderá e tiponan di sèl den e mikroambiente komo kada grupo (n = 6 grupo); pa e tèst di signifikansia, nos a hasi tres midimentu ripití pa kada metabolito Pa evitá replikashon falsu, e pashènt a wòrdu inkluí komo un opstákulo den e diseño di limma. Pa por kontrolá e diferensianan den metabolitonan entre diferente pashènt, nos a ahusta e modelo di limma inkluyendo pashèntnan na un manera fiho. Nos ta informá e nifikashon di e kontraste pre-spesifiká entre e tipo di sèl i e mikroambiente di Padj <0.05 (korekshon di Benjamini-Hochberg).
Despues di enrikesimentu di vigor usando Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% viabilidat), sekuensiamentu di transkriptoma di un solo sèl a wòrdu realisá riba e totalidat di muestranan di ascites i tumor bibu kongelá usando un protokòl di ekspreshon di gene 10x 5′. Sinku kaso ku tumornan i ascites paresido a wòrdu analisá, ounke e viabilidat abou di un muestra di tumor a prevení su inklushon. Pa por logra selekshonnan múltiple di pashènt, nos a kombiná e muestranan di kada pashènt den e liñanan di e kontroladó di kromo 10x, i a analisá e ascites i e sitionan di tumor separadamente. Despues di sekuensiamentu [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), genoma di Quebec; un promedio di 73.488 i 41.378 lesamentu pa sèl pa tumor i ascites respektivamente]], nos a usa CellSNP i Vireo (53) (basá riba CellSNP komo E SNP humano komun (VCF) suministrá pa GRCh38 ta wòrdu asigná un identidat di donante. Nos ta usa SNPRelate pa inferí e identidat mas serka (IBS) di e status di genotipo di pashènt (IBS) ekskluíndo sèlnan no asigná i sèlnan identifiká komo dúplex i donantenan ku ta kuadra entre muestranan di ascites i tumor (54 A base di e tarea aki, nos a retené tres kaso ku representashon di sèl abundante den e tumor i ascites pa analisis di downstream Despues di a realisá un paso di filtrashon di masa den e scater (55) i scran (56) Bioconductor, a duna e sèlnan aki 67. (2792 i 4183 sèl di tumor i ascites, respektivamente) pa analisis Nos ta usa e agrupashon di igraph (57) Louvain di e ret di bisiña mas serka kompartí (SNN) basá riba e distansia di Jaccard pa e sèlnan di agrupashon pa medio di ekspreshon. celnan ta wòrdu definí dor di e ekspreshon di CD8A i GZMA, ekskluyendo subgruponan ku ekspreshon abou di proteina ribosomal Nos a aksesá e datonan publiká di Izar et al (16), inkluyendo nan inkorporashon di t-SNE, por kontrolá e overlap di ekspreshon entre markadónan di cel inmune i ekspreshon di NNMT.
PBMC a wòrdu separá for di produktonan di separashon di leukosito (STEMCELL Technologies) dor di sentrifugashon di densidat di gradiente di Ficoll. CD3 + celnan a wòrdu isolá for di PBMC usando CD3 beads (Miltenyi). Den presensia òf ousensia di MNA, celnan CD3+ a wòrdu aktivá ku CD3 mará na plaka (5μg/ml), CD28 solubel (3μg/ml) i IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Riba e último dia di ekspanshon, e viabilidat (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) i proliferashon (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) a wòrdu evaluá pa medio di sitometria di fluho. Evaluá funshon di efektor dor di stimulá celnan ku PMA (20 ng/ml) i ionomycin (1μg/ml) ku GolgiStop pa 4 ora, i monitor CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) i TNFα-fluoresceinsothianate (TCMA-T4,1) BD). Stimulá celnan qPCR i ChIP ku PMA (20 ng/ml) i ionomycin (1μg/ml) pa 4 ora. E supernatante di ELISA a wòrdu rekohé promé i despues di stimulashon ku PMA (20 ng/ml) i ionomisina (1 μg/ml) pa 4 ora.
Sigui e protokòl di e fabrikante pa isolá RNA usando RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Usa QIAshredder (QIAGEN) pa homogeneisá e muestra. Usa e kit di RNA pa cDNA di kapasidat haltu (Thermo Fisher Scientific) pa sintetisá DNA komplementario (cDNA). Usa TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) pa kuantifiká ekspreshon di gene (di akuerdo ku e protokòl di e fabrikante) ku e siguiente sondeonan: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427555m1 (AOX1), Hs004 Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate for Hydrogeno (GAPDH)] i Hs01010726_m1 (SLC22A2). E muestranan a wòrdu kore riba e sistema di PCR den tempu real StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) den e plachi di reakshon optiko rápido di 96 pos di MicroAmp (Applied Biosystems) ku pelíkula optiko di MicroAmp. Kualke balor di Ct ku surpasá 35 ta wòrdu konsiderá riba e límite di detekshon i ta wòrdu marká komo indetektabel.
Hasi ChIP manera deskribí anteriormente (58). Den kòrtiku, e sèlnan a wòrdu tratá ku formaldehído (konsentrashon final 1.42%) i inkubá na temperatura di kamber pa 10 minüt. Usa un buffer di hinchamentu suplementá (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl i 0.1% NP-40) riba ijs pa 10 minüt, despues resuspendé den un buffer di imunopresipitashon manera deskribí (58 ). E muestra despues a wòrdu soniká ku e siguiente siklonan: 10 siklo (20 pulso di 1 sekònde) i un tempu státiko di 40 sekònde. Inkubá antikurpanan di ChIP-grade immunoglobulin G (Cell Signaling Technology; 1μl), histon H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) i SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) ku e muestra na 4°CC sagudí henter anochi. Inkubá e kralnan di proteina A (Thermo Fisher Scientific) ku e muestra na 4°C ku sagudí suave pa 1 ora, despues usa kralnan di chelex (Bio-Rad) pa enrikesé e DNA, i usa proteinase K (Thermo Fisher) pa digestion di proteina. Promotor di TNFα a wòrdu detektá pa medio di PCR: dilanti, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; al kontrario, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp produkto). E imágennan a wòrdu produsí pa Image Lab (Bio-Rad) i kuantifiká usando software ImageJ.
E supernatante di kultura di cel a wòrdu rekohé manera deskribí ariba. E determinashon a wòrdu realisá segun e proseduranan di e fabrikante di e kit di ELISA di TNFα humano (Invitrogen), e kit di ELISA di IL-2 humano (Invitrogen) i e kit di ELISA di IFN-γ humano (Abcam). Di akuerdo ku e protokòl di e fabrikante, e supernatante a wòrdu diluí 1:100 pa detektá TNFα i IL-2, i 1:3 pa detektá IFN-γ. Usa EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) pa midi absorbensia na 450 nm.
PBMC a wòrdu separá for di produktonan di separashon di leukosito (STEMCELL Technologies) dor di sentrifugashon di densidat di gradiente di Ficoll. CD3 + celnan a wòrdu isolá for di PBMC usando CD3 beads (Miltenyi). Den presensia òf ousensia di MNA, celnan CD3+ a wòrdu aktivá ku CD3 mará na plaka (5μg/ml), CD28 solubel (3μg/ml) i IL-2 (300 U/ml; Proleukin) pa 3 dia. Despues di 3 dia, e sèlnan a wòrdu rekohé i labá ku 0.9% di salina, i e pèlèt a wòrdu kongelá. Konteo di cel a wòrdu realisá pa medio di sitometria di fluho (Cytek Aurora; konfigurashon 3L-16V-14B-8R) usando eBeads di 123count.
Saka metabolitonan manera deskribí ariba. E ekstrakto seku a wòrdu rekonstituí na un konsentrashon di 4000 ekivalente di sèl/μl. Analisá e muestra pa medio di kromatografia di fase invertí (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) i kolumna CORTECS T3 (2.1×150 mm, tamaño di partikulo 1.6-μm, tamaño di poro 120-Å; #186008500, Waters). Spektrometer di masa polar (6470, Agilent), den kua ionisashon di elektrospray ta operá den moda positivo. Fase mobil A ta 0.1% asido fórmiko (den H2O), fase mobil B ta 90% asetonitrilo, 0.1% asido fórmiko. E gradiente di LC ta 0 pa 2 minüt pa 100% A, 2 pa 7.1 minüt pa 99% B, i 7.1 pa 8 minüt pa 99% B. Despues re-ekilibrá e kolumna ku fase mobil A na un fluho di 0.6 ml/min pa 3 minüt. . E fluho ta 0.4ml/min, i e kamber di kolumna ta wòrdu keintá te na 50°C. Usa e norma kímiko puru di MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) pa establesé tempu di retenshon (RT) i transformashon (RT = 0.882 minüt, transformashon 1 = 137→94.1, transformashon 2 = 137→92 , Konvershon = 17→77). Ora tur tres transishon ta sosodé na e tempu di retenshon korekto, transishon 1 ta wòrdu usá pa kuantifikashon pa garantisá spesifisidat. E kurva standart di MNA (Toronto Research Chemical Company) a wòrdu generá dor di seis dilushon serial di e solushon di stòk (1 mg/ml) pa optené standartnan di 0.1, 1.0, 10 i 100 ng/ml i 1.0 i 10μg/ml respektivamente líkido. E límite di detekshon ta 1 ng/ml, i e kontesta lineal ta entre 10 ng/ml i 10μg/ml. Kada inyekshon di dos mikroliter di muestra i standart ta wòrdu usá pa analisis di LC/MS, i un muestra di kòntròl di kalidat miksto ta wòrdu kore kada ocho inyekshon pa garantisá e stabilidat di e plataforma di analisis. E kontesta di MNA di tur e muestranan di cel tratá ku MNA tabata denter di e rango lineal di e ensayo. Análisis di dato a wòrdu hasí usando e software di analisis kuantitativo di MassHunter (v9.0, Agilent).
E konstrukto di αFR-CAR di di dos generashon a wòrdu tumá for di Song et al. (59). Den kòrtiku, e konstrukto ta kontené e siguiente kontenido: sekuensia di lider di CD8a, fragmento variabel di kadena úniko spesífiko pa αFR humano, scharnier di CD8a i region di transmembrana, dominio intraselular CD27 i dominio intraselular CD3z. E sekuensia kompleto di CAR a wòrdu sintetisá pa GenScript, i despues klon den e vektor di ekspreshon lentiviral di di dos generashon ariba di e kasete di ekspreshon di GFP ku a wòrdu usá pa evaluá e efisiensia di transdukshon.
Lentivirus ta wòrdu produsí dor di transfekshon di celnan HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); krese den e medio Eagle modifiká di Dulbecco ku ta kontené 10% suero bovino fetal (FBS) i 1% PenStrep, i a usa vektor CAR-GFP i E plasmidonan di pakete (psPAX2 i pMD2.G, Addgene) ta usa amina di lipofekshon (Sigma-Aldrich). E supernatante ku ta kontené vírùs a wòrdu rekohé 48 i 72 ora despues di transfekshon, filtrá i konsentrá pa medio di ultrasentrifugashon. Warda e supernatante viral konsentrá na -80°C te ora di transdukshon.
PBMC ta wòrdu separá for di produktonan di separashon di leukosito di donante saludabel (STEMCELL Technologies) dor di sentrifugashon di densidat di gradiente di Ficoll. Usa mikrobeads di CD8 di selekshon positivo (Miltenyi) pa isolá celnan CD8+ for di PBMC. Stimulá sèlnan T ku TransAct (Miltenyi) i den medio TexMACS [Miltenyi; suplementá ku 3% di suero humano inaktivá pa kalor, 1% di PenStrep i IL-2 (300 U/ml)]. Binti-kuater ora despues di stimulashon, e sèlnan T a wòrdu transdusí ku lentivirus (10 μl di supernatante di vírùs konsentrá pa kada 106 sèl). 1 pa 3 dia despues di transdukshon riba Cytek Aurora (riba FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), evaluá e ekspreshon di GFP di e sèlnan pa demostrá un efisiensia di transdukshon di por lo ménos 30% .
CAR-T celnan a wòrdu kultivá pa 24 ora den Immunocult (STEMCELL Technologies; suplementá ku 1% PenStrep) bou di e siguiente kondishonnan: no tratá, tratá ku 250 μM adenosina òf 10 mM MNA. Despues di pretratamentu, e sèlnan CAR-T a wòrdu labá ku PBS i kombiná ku 20.000 sèl SK-OV-3 [ATCC; den medio McCoy 5A (Sigma-Aldrich) suplementá ku 10% FBS i 1% PenStrep na 10: E relashon efektor pa meta di 1 a wòrdu amplifiká den triplikado den medio Immunocult suplementá. SK-OV-3 sèlnan i SK-OV-3 sèlnan lisá ku digitalis saponin (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) a wòrdu usá komo kòntròlnan negativo i positivo, respektivamente. Despues di 24 ora di ko-kultivashon, e supernatante a wòrdu rekohé i e lactate dehydrogenase (LDH) a wòrdu midi segun e instrukshonnan di e fabrikante (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). E supernatante di LDH a wòrdu diluí 1:50 den un buffer di LDH. E porsentahe di matamentu a wòrdu midi usando e siguiente fórmula: porsentahe di matamentu = porsentahe di korekshon / tasa máksimo di matamentu x 100%, kaminda porsentahe di korekshon = ko-kultura-selnan T so, i tasa máksimo di matamentu = kontrol positivo-kontrol negativo.
Manera deskribí den e teksto òf materialnan i métodonan, usa GraphPad Prism 8, Microsoft Excel òf R v3.6.0 pa analisis estadístiko. Si ta rekohé vários muestra for di e mesun pashènt (manera ascites i tumor), nos ta usa un tèst di t pareá òf ta inkluí e pashènt komo un efekto aleatorio den un modelo lineal òf generalisá segun ta apropiá. Pa analisis di metabolomia, e tèst di importansia ta wòrdu realisá den triplikado.
Pa materialnan suplementario pa e artíkulo aki, por fabor wak http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Esaki ta un artíkulo di akseso habrí distribuí bou di e términonan di e Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, ku ta pèrmití e uso, distribushon i reprodukshon den kualke medio, basta ku e uso final no ta pa ganashi komersial i e premisa ta ku e obra original ta korekto. Referensia.
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Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephherson (R.R. Bellnis), Deraphardnis. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA ta kontribuí na e supreshon di sistema imunológiko di celnan T i ta representá un potensial meta di imunoterapia pa tratamentu di kanser humano.
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MNA ta kontribuí na e supreshon di sistema imunológiko di celnan T i ta representá un potensial meta di imunoterapia pa tratamentu di kanser humano.
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