Sorteo di proteina den e trayekto sekretorio ta esensial pa mantené kompartimentashon di cel i homeostasis. Ademas di e sorteo media pa kaska, e ròl di lipidonan den sorteo di kinesin den e proseso di transporte sekretorio ta un pregunta básiko di hopi tempu ku no a wòrdu kontestá ainda. Aki, nos ta hasi imágennan multikolor simultáneo 3D di resolushon haltu den tempu real pa proba in vivo ku proteinanan inmobilisá ku glikosilfosfatidilinositol resien sintetisá ku frakshonnan di lípido di seramida hopi largu ta wòrdu agrupá i klasifiká den endoplasmanan spesialisá Net exit site, ku ta diferente for di esun ku ta wòrdu usá pa proteinanan transmembrana. Ademas, nos ta mustra ku e largura di kadena di seramida den e membrana di retíkulo endoplasmátiko ta krusial pa e selektividat di klasifikashon aki. Nos estudio ta proveé ​​e promé evidensia direkto in vivo pa klasifiká karganan di proteina basá riba largura di kadena di lipid den sitionan di eksportashon selektivo den e trayekto sekretorio.
Den celnan eukariota, e proteinanan sintetisá den e retíkulo endoplasmátiko (ER) ta wòrdu ordená durante transporte a traves di e trayekto sekretorio pa entrega na nan destinashon selular apropiá (1). Ademas di e klasifikashon media pa kapa, pa hopi tempu tabata spekulá ku sierto lipidnan por sirbi tambe komo puntonan di salida selektivo dor di agrupá nan den dominionan spesífiko di membrana ku proteinanan spesífiko (2-5). Sinembargo, ainda tin un falta di evidensia direkto in vivo pa proba e posibel mekanismo basá riba lipid aki. Pa por solushoná e problema básiko aki, nos a studia den yeast kon e proteinanan ankrá di glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GPI-APs) ta wòrdu eksportá diferensialmente for di e ER. GPI-APs ta un variedat di proteina di superfisie di cel konektá ku lipid ( 6, 7). GPI-AP ta un proteina sekretá pegá na e foyetonan eksterno di e membrana di plasma a traves di e parti di glikolipido (anker di GPI). Nan ta aseptá ankernan di GPI komo modifikashonnan konservativo post-translashonal den e lumen di ER (8). Despues di atachamentu, GPI-AP ta pasa dor di e aparato di Golgi (5, 9) for di e ER pa e membrana di plasma. E presensia di ankernan di GPI ta kousa ku GPI-AP ta wòrdu transportá separá for di proteinanan sekretá transmembrana (inkluso otro proteinanan di membrana di plasma) kantu di e trayekto sekretorio (5, 9, 10). Den celnan di yeast, GPI-APs ta wòrdu separá for di otro proteinanan sekretá den e retíkulo endoplasmátiko, i despues ta wòrdu paketá den vesikulonan úniko envolví pa e kompleho di proteina di kapa II (COPII) (6, 7). E determinantenan di e proseso di klasifikashon aki den e proseso di eksportashon di ER no ta kla, pero ta spekulá ku e mekanismo aki por rekerí lipid, spesialmente e remodelashon struktural di e porshon di lipid di e anker di GPI (5, 8). Den ist, remodelashon di lipid di GPI ta kuminsá mesora despues ku e GPI ta pega, i den hopi kaso, e ta kousa ku seramida ta mara na e asido graso saturá di kadena largu di 26 karbon (C26:0) (11, 12). C26 ceramide ta e ceramide principal produci pa celnan di yeast te awor. E ta wòrdu sintetisá den e ER i mayoria di dje ta wòrdu eksportá pa e aparato di Golgi a traves di vesikulonan di COPII (13). E eksportashon di ER di GPI-AP spesífikamente ta rekerí síntesis di seramida kontinuo (14, 15), i na su turno, e kombershon di seramida pa inositol fosfato seramida (IPC) den e aparato di Golgi ta dependé di sintesis di anker di GPI (16). Estudionan biofísiko ku membrananan artifisial a mustra ku seramidenan di kadena asil hopi largu por uni pa forma dominionan ordená ku propiedatnan físiko úniko (17, 18). E datonan aki ta kondusí na e hipótesis ku C26 ceramide i GPI-AP ku C26 ceramide ta usa nan propiedatnan físiko pa uni den regionnan òf regionnan ordená den e ambiente di lípido di membrana di ER relativamente desordená. E ta komponé prinsipalmente di gliserolipidonan kòrtiku i insatura (C16:1 i C18:1) (19, 20). E regionnan aki lo ta selektivamente enfoká riba sitionan di salida spesífiko di ER (ERES), kaminda seramida i GPI-AP basá riba seramida por wòrdu ko-transportá pa e Golgi den e mesun vesikula COPII dediká (5).
Den e estudio aki, nos a tèst direktamente e mekanismo basá riba lipid aki dor di usa mikroskopia di imágen konfokal den tempu real di super-resolushon (SCLIM), ku ta un téknika di mikroskopia di punta ku por opservá simultáneamente proteinanan marká ku fluoresente E imágennan di tres koló i tres dimenshon (3D) tin un resolushon sumamente haltu i den sèlnan bibu (21, 22).
Promé nos a apliká teknologia SCLIM pa definí mas aleu kon GPI-AP normal ku grupo di seramida C26 a wòrdu screen for di proteinanan sekretá di transmembrana despues di a bandoná e ER den S. cerevisiae. Pa por kontrolá e klasifikashon di ER, nos a usa un sistema genétiko ku por visualisá direktamente karga nobo sintetisá drentando ERES in vivo (7, 23). Komo karga, nos a skohe GPI-AP Gas1 basá riba seramida C26 marká ku proteina fluoresente bèrdè (GFP) i proteina sekretá di transmembrana Mid2 marká ku proteina fluoresente serka-infrakòrá (iRFP), kual tur dos ta dirigí riba e membrana di plasma (24–26). Den e mutante sensitivo na temperatura sec31-1, e dos karganan aki ta wòrdu ekspresá bou di un promotor indusibel pa galaktosa i un markadó konstitutivo di ERES. Na e temperatura ekstremo (37°C), pasobra e mutashon sec31-1 ta afektá e funshon di e komponente di e kapa di COPII Sec31 pa inhibi germinashon di COPII i eksportashon di ER, karga nobo sintetisá ta akumulá na e ER (23). Despues di fria na un temperatura abou (24°C), e sèlnan mutante sec31-1 a rekuperá for di e área sekretorio, i e karga sintétiko nobo akumulá a kuminsá wòrdu eksportá for di e ER. Visualisashon di CLIM a mustra ku mayoria di e Gas1-GFP i Mid2-iRFP resien sintetisá ainda tabata akumulá den e ER di e sèlnan mutante sec31-1 despues di inkubashon na 37°C i despues a wòrdu liberá na 24°C pa 5 minüt (Figura 1). Komo ku Mid2-iRFP ta distribuí riba henter e membrana di ER, i Gas1-GFP ta konsentrá i reuní den e área di membrana di ER diskontinuo, nan distribushon ta kompletamente diferente (Figura 1, A pa C i Pelíkula S1). Ademas, manera ta mustra den Figura 1D, e klúster di Gas1-GFP no tin Mid2-iRFP. E resultadonan aki ta indiká ku GPI-AP i proteinanan transmembrana a wòrdu separá den diferente region di membrana di ER trempan. E klúster di Gas1-GFP ta banda di un ERES spesífiko marká ku e proteina di kapa COPII di mCherry Sec13 (Figura 1, E i F, i pelíkula S1) (23).
sèlnan sec31-1 ta ekspresá sekreshonnan indusí pa galaktosa, un kadena largu di asil (C26) seramida GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, bèrdè) i e proteina transmembrana Mid2-iRFP (TMP, blou) i e markashon di ERES konstruktivo aki Sec13-mCherry (E) a wòrdu inkubá na RES13°3, minüt, move pa 24°C, i imágen pa SCLIM 5 minüt despues. (A pa C) ta mustra un imágen 2D representativo kombiná òf úniko di un plano (A), un imágen di proyekshon 2D di 10 z-sekshon (B) òf un imágen di hemisferio di cel 3D di markadónan di karga i ERES (C). Barra di eskala 1μm (A i B). E unidat di eskala ta 0.551μm (C). Gas1-GFP a wòrdu detektá den regionnan òf klústernan diskreto di ER, miéntras ku Mid2-iRFP a wòrdu detektá i distribuí den henter e membrana di ER (C). (D) E grafiko ta mustra e intensidat di fluorescencia relativo di Gas1-GFP i Mid2-iRFP den e klúster di Gas1-GFP kantu di e liña di flecha blanku (na robes). AU, unidat arbitrario. (E i F) ta representá e imágen 3D ku ta kombiná e merkansia i e marka ERES. A detektá gruponan di Gas1-GFP serka di e ERES spesífiko. E unidat di eskala ta 0.551μm. (F) E flecha sólido blanku ta marka e grupo di Gas1-GFP asosiá ku ERES. E panelnan meimei i drechi ta mustra e imágen 3D engrandesé kombiná i un bista rotá di e klúster di Gas1-GFP selektá.
E relashon espasial estrecho entre e klúster di Gas1-GFP i un ERES spesífiko ta indiká ku Gas1-GFP por drenta ERES selektivo, ku ta diferente for di e selektividat usá pa Mid2-iRFP pa sali for di e ER. Pa atendé e posibilidat aki, nos a kalkulá e relashon di ERES pa solamente un òf dos produkto (Figura 2, A pa C). Nos a haña ku mayoria di ERES (70%) ta kontené solamente un tipo di karga. E imágen abou di Figura 2C ta mustra dos ehèmpel típiko di ERES ku solamente Gas1-GFP (Figura 1) òf solamente Mid2-iRFP (Figura 2). Na kontraste, aproksimadamente 20% di ERES ta kontené dos karga ku ta overlap den e mesun área. A haña ku algun ERES (10%) tabata kontené dos tipo di karga, pero nan tabata isolá den áreanan klaramente diferente. P’esei, e analisis estadístiko aki ta mustra ku despues ku e ER ta wòrdu eksportá, GPI-AP Gas1-GFP i e karga transmembrana Mid2-iRFP ta wòrdu dividí den diferente ERES (Figura 2D). E efisiensia di klasifikashon aki ta hopi konsistente ku e analisis biokímiko anterior (6) i determinashon morfológiko (7). Nos por opservá tambe e komportashon di e karga den karentena ku ta drenta ERES (Figura 2E i Pelíkula S2). Figura 2E ta mustra ku solamente un parti chikitu di Gas1-GFP (panel 3) òf Mid2-iRFP (panel 4) ta drenta e ERES for di un banda i ta limitá den un área diskreto. Panel 5 di Figura 2E ta mustra ku Gas1-GFP i Mid2-iRFP tin bia ta wòrdu hañá den e mesun ERES, pero nan ta drenta for di diferente banda i ta konsentrá den regionnan separá ku por representá diferente vesikula COPII. Nos a konfirmá tambe ku e separashon i klasifikashon opservá di GPI-AP Gas1 basá riba C26 ceramide komo ERES selektivo ta spesífiko pasobra un otro karga di sekreshon transmembrana, e proteina di membrana di plasma marká ku GFP Axl2 (27 ), ta mustra komportashon similar na Mid2-iRFP. (Potrèt S1 i Pelíkula S3). E Axl2-GFP resien sintetisá ta wòrdu distribuí a traves di e membrana di ER manera Mid2-iRFP (Figura S1, A i B), i ta ko-lokalisá ku Mid2-iRFP den mayoria di ERES (Figura S1, B pa D). Panelnan 1 i 2 di Figura 1. S1C ta mustra dos ehèmpel típiko di ERES kaminda dos karga transmembrana ta overlap. Den e kasonan aki, tur dos merkansia ta drenta ERES huntu (Figura S1E, Panel 3 i Pelíkula S3).
E sèlnan sec31-1 ku ta ekspresá sekreshonnan indusibel di galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, bèrdè) i Mid2-iRFP (TMP, blou) i ERES konstitutivo ku ta marka Sec13-mCherry (ERES, magenta) a wòrdu poné na 37 Despues di inkubá pa 30 minüt na °C, move pa e ion di sekreshon i blòkia ku SCLIM despues di 20 minüt. (A pa C) Imágennan di proyekshon 2D representativo (A; bar di eskala, 1μm) òf imágennan di hemisferio di cel 3D (B i C; unidat di eskala, 0.456μm) di e karga i 10 z-sekshon marká pa ERES. E panel mas abou den (B) i e panel den (C) ta mustra imágennan prosesá pa mustra solamente e merkansia presente den ERES (magenta) [Gas1-GFP (gris) i Mid2-iRFP (blou kla)]. (C) Flecha habrí: ERES ta karga solamente un pida karga (1 pa 4). Flecha gris: ERES ta kontené karga separá (5). Flecha sólido blanku: ERES ku ta kontené karga ko-lokalisá. Abou: E ERES úniko selektá ta kontené solamente Gas1-GFP (1) òf Mid2-iRFP (2). Bara di eskala, 100 nm. (D) Kuantifikashon di e fotomikrografia deskribí den (C). E porsentahe promedio di ERES ku ta kontené solamente un karga (Gas1-GFP òf Mid2-iRFP), karga separá i karga ku ta overlap. Den tres eksperimento independiente, n=432 den 54 sèl. Bara di eror = SD. Prueba di t sin pareha di dos rabo. *** P = 0.0002. (E) Imágen 3D di ERES selektá di karga den karentena marká ku (C). Gas1-GFP (bèrdè) (3) òf Mid2-iRFP (blou) (4) ta drenta ERES (magenta) for di un banda i ta restringí na un área chikitu denter di ERES. Tin bia, tur dos tipo di karga ta drenta e mesun ERES (5) for di e mesun banda i ta wòrdu limitá na un área isolá denter di e ERES. Barra di eskala, 100 nm.
Siguientemente, nos a tèst un hipótesis ku e seramida di kadena largu di asil (C26) presente den e membrana di ER ta impulsá e agrupashon i klasifikashon spesífiko di Gas1 den ERES selektivo. Pa esaki, nos a usa un strain di yeast modifiká GhLag1, den kua e dos sintasanan di seramida endógeno Lag1 i Lac1 a wòrdu remplasá pa GhLag1 (e homólogo Lag1 di katuna), resultando den un strain di yeast ku un strain di Ceramide di membrana di cel mas kòrtiku ku tipo salbahe (Figura 3A) (28). Análisis di spektrometria di masa (MS) a mustra ku den strainnan di tipo salbahe, 95% di e seramida total ta seramida di kadena hopi largu (C26), miéntras ku den GhLag1, 85% di e seramida ta hopi largu (C18 i C16). ), solamente 2% di seramida ta seramida di kadena hopi largu (C26). Aunke C18 i C16 ceramides ta e principal ceramides detektá den e membrana di GhLag1 te awor, analisis di MS tambe a konfirmá ku e anker GPI di Gas1-GFP ekspresá den e strain GhLag1 ta kontené C26 ceramide, ku ta komparábel ku lipidonan di tipo salbahe. E kalidat ta meskos (Fig. 3A) (26). P’esei, esaki ta nifiká ku e enzima di remodelashon di seramida Cwh43 ta altamente selektivo pa seramida C26, manera ta mustra den Figura 26, e ta inkorporá preferensialmente e anker di GPI for di un kantidat chikitu di seramida C26 den e strain GhLag1. S2 (29). Sinembargo, e membrana di cel di GhLag1 básikamente ta kontené solamente C18-C16 ceramide, miéntras ku Gas1-GFP ainda tin C26 ceramide. E echo aki ta hasi e strain aki un herment ideal pa solushoná spesífikamente e problema di e largura di kadena di asil di seramida di membrana den e ER. E ròl hipotétiko di klase i sorteo. Despues, nos a studia promé e abilidat di C26 Gas1-GFP pa akumulá den gruponan den GhLag1 ku un alelo mutante sensitivo na temperatura di sec31-1 a traves di mikroskopia di fluorescencia konvenshonal, kaminda solamente e kadena largu (C18-C16) ta eksistí den e membrana di ER Ceramide (Fig. 3). Nos a opservá ku den sec31-1, mayoria di Gas1-GFP tabata konsentrá den klúster, miéntras ku Gas1-GFP den sec31-1 GhLag1 ku membrana largu (C18-C16) largu di seramida ER prinsipalmente no tabata agrupá i distribuí den Den henter e membrana ER. Pa ta presis, dor ku e agrupashon basá riba seramida C26 ta estrechamente relashoná ku ERES spesífiko (Figura 1), nos a investigá despues si e proseso aki por enserá tambe e funshon di e mekanismo di proteina di eksportashon di ER. GPI-AP ta usa un sistema spesial di COPII pa eksportashon di ER, ku ta wòrdu regulá aktivamente dor di e remodelashon struktural di Ted1 di e porshon di glikan di e anker di GPI (30, 31). E GPI-glikan rekombinante ta wòrdu rekonosé despues dor di e kompleho di reseptor di karga transmembrana p24, ku na su turno ta rekrutá selektivamente Lst1, ku ta un isoforma spesífiko di e subunidad prinsipal di unimentu di karga di COPII Sec24, formando un COPII riku na GPI-AP Vesíkulonan ta nesesario (31-33). P’esei, nos a konstruí un mutante dòbel ku a kombiná e deleshon di e proteinanan individual aki (e komponente kompleho p24 Emp24, e enzima di remodelashon di GPI-glikan Ted1 i e subunidad spesífiko di COPII Lst1) ku e strain mutante sec31-1, i a studia nan Ta posibel pa forma Gas1-Luster GFP (Figura 3). Nos a opservá ku den sec31-1emp24Δ i sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP no ta prinsipalmente agrupá i distribuí den henter e membrana di ER, manera a mira anteriormente den sec31-1 GhLag1, miéntras ku den sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Meskos ku sec31-1-1. E resultadonan aki ta indiká ku ademas di e presensia di C26 ceramide den e membrana di ER, e agrupashon di Gas1-GFP tambe mester mara na e kompleho p24, i no ta rekerí rekrutamentu spesífiko di Lst1. Despues, nos a eksplorá e posibilidat ku e largura di kadena di seramida den e membrana di ER por regulá e union di Gas1-GFP na p24. Sinembargo, nos a haña ku e presensia di seramida C18-C16 den e membrana no ta afektá e GPI-glikanonan rekonstruí pa e kompleho p24 (Figuranan S3 i S4, A i B) òf uni na GPI-AP i eksportá GPI-AP. abilidat. Reklutá COPII subtipo Lst1 (Figura S4C). P’esei, agrupashon dependiente di seramida C26 no ta rekerí interakshonnan di proteina ku diferente mekanismo di proteina di eksportashon di ER, pero ta sostené un mekanismo di klasifikashon alternativo impulsá pa largura di lipid. Despues, nos a analisá si e largura di e kadena di asil di seramida den e membrana di ER ta importante pa e klasifikashon efektivo di Gas1-GFP komo ERES selektivo. Komo ku Gas1 den e strain GhLag1 ku seramida di kadena kòrtiku ta sali for di e ER i ta drenta e membrana di plasma (Figura S5), nos ta kere ku si e sorteo ta wòrdu impulsá pa e largura di e kadena di asil di seramida, e Gas1 den e strain GhLag1 por wòrdu redirigi i krusa. merkansia di ERES ku e mesun membrana.
(A) E membrana di cel di GhLag1 ta kontené prinsipalmente seramidanan C18-C16 mas kòrtiku, miéntras ku e anker GPI di Gas1-GFP ainda tin e mesun C26 IPC ku celnan di tipo salbahe. Ariba: analisis di largura di kadena di asil di seramida den e membrana di cel di tipo salbahe (Wt) i GhLag1p pa medio di spektrometria di masa (MS). E datonan ta representá e porsentahe di seramida total. E promedio di tres eksperimento independiente. Bara di eror = SD. Prueba di t sin pareha di dos rabo. **** P ＜0.0001. Panel di abou: Análisis di MS di e largura di e kadena di asil di e IPC presente den e anker di GPI di Gas1-GFP (GPI-IPC) ekspresá den e strainnan di tipo salbahe i GhLag1p. E datonan ta representá e porsentahe di e señal total di IPC. Promedio di sinku eksperimento independiente. Barra di eror = SD. Prueba di t sin pareha di dos rabo. ns, no ta importante. P = 0.9134. (B) Mikrografianan di fluorescencia di sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ i sec31-1lst1Δ celnan ku ta ekspresá Gas1-GFP indusí pa galaktosa a wòrdu inkubá na 37°C pa 30 minüt pasá i a hasi rutina abou mikroskopia despues di 24°C. Flecha blanku: ER Gas1-GFP cluster. Flecha habrí: Gas1-GFP sin agrupashon ta distribuí riba henter e membrana di ER, mustrando e manchamentu di e ring nuklear karakterístiko di ER. Bara di eskala, 5μm. (C) Kuantifikashon di e fotomikrografia deskribí den (B). E porsentahe promedio di celnan ku struktura di Gas1-GFP punteá. Den tres eksperimento independiente, n≥300 sèl. Bara di eror = SD. Prueba di t sin pareha di dos rabo. **** P ＜0.0001.
Pa solushoná e problema aki direktamente, nos a realisá visualisashon SCLIM di Gas1-GFP i Mid2-iRFP den GhLag1 ku e alelo mutante sensitivo na temperatura sec31-1 (Figura 4 i Pelíkula S4). Despues ku e ER a wòrdu retené na 37°C i posteriormente liberá na 24°C, mayoria di e Gas1-GFP resien sintetisá no a wòrdu agrupá i distribuí den henter e membrana di ER, manera opservá pa mikroskopnan konvenshonal (Figura 4, A i B ). Ademas, un porsentahe grandi di ERES (67%) ta inkluí dos tipo di karga ko-lokalisá den dje (Figura 4D). Panelnan 1 i 2 di Figura 4C ta mustra dos ehèmpel típiko di ERES ku Gas1-GFP i Mid2-GFP ku ta overlap. Ademas, tur dos merkansia a wòrdu rekrutá den e mesun ERES (Figura 4E, panel 3 i pelíkula S4). P’esei, nos resultadonan ta indiká ku e largura di e kadena di asil di seramida den e membrana di ER ta un determinante importante di agregashon i klasifikashon di proteina di ER.
Sec31-1 GhLag1 sèlnan ku ta ekspresá sekreshonnan indusí pa galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, bèrdè) i Mid2-iRFP (TMP, blou) i Sec13-mCherry (ERES, magenta) marká ku ERES konstitutivo Inkubá na 37°C. Sigui pa 30 minüt, baha na 24°C pa saka sekreshonnan, i imágen ku SCLIM despues di 20 minüt. (A pa C) Imágennan di proyekshon 2D representativo (A; bar di eskala, 1μm) òf imágennan di hemisferio di cel 3D (B i C; unidat di eskala, 0.45μm) di e 10 z-sekshonnan marká pa karga i ERES. E panel mas abou den (B) i e panel den (C) ta mustra imágennan prosesá pa mustra solamente e merkansia presente den ERES (magenta) [Gas1-GFP (gris) i Mid2-iRFP (blou kla)]. (C) Flecha yená blanku: ERES, ta overlap di merkansia. Flecha habrí: ERES ta kontené solamente un artíkulo. Panel mas abou: E ERES selektá tin merkansia ku ta overlap (1 i 2) marká den (C). Bara di eskala, 100 nm. (D) Kuantifikashon di e fotomikrografia deskribí den (C). Den e unidatnan sec31-1 i sec31-1 GhLag1, solamente un karga (Gas1-GFP òf Mid2-iRFP) ta inkluí, i e porsentahe promedio di ERES pa karga isolá i karga ku ta overlap. Den tres eksperimento independiente, n = 432 den 54 sèl (sec31-1) i n = 430 den 47 sèl (sec31-1 GhLag1). Barra di eror = SD. Prueba di t sin pareha di dos rabo. *** P = 0.0002 (sec31-1) i ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Imágen 3D di ERES selektá ku karga ku ta overlap (3) marká den (C). Gas1-GFP (bèrdè) i Mid2-iRFP (blou) ta aserka ERES (magenta) for di e mesun banda i ta keda den e mesun área restringí di ERES. Bara di eskala, 100 nm.
E estudio aki ta proveé ​​evidensia direkto in vivo ku karganan di proteina basá riba lipid ta wòrdu klasifiká den sitionan di eksportashon selektivo den e trayekto sekretorio, i ta revelá e importansia di largura di kadena di asil pa selektividat di klasifikashon. Usando un téknika di mikroskopia poderoso i di punta yamá SCLIM, nos a demostrá e Gas1-GFP resien sintetisá (un GPI-AP di membrana di plasma prinsipal ku un porshon di lípido di seramida di kadena di asil (C26) hopi largu) den ist) E regionnan agrupá den ERnan diskreto ta asosiá ku EERRES spesífiko, miéntras ku proteinanan transmembrana ta wòrdu distribuí a traves di e membrana ERRES (Figura 1). Ademas, e dos tipo di merkansia aki ta drenta diferente ERES selektivamente (Figura 2). E largura di e kadena di asil di e seramida selular den e membrana ta wòrdu redusí di C26 pa C18-C16, e klúster di Gas1-GFP ta wòrdu strobá den e region diskreto di ER, i Gas1-GFP ta wòrdu redirigí pa sali for di e ER ku e proteina transmembrana a traves di e mesun ERES (Figura 3 i Figura 3). 4).
Aunke GPI-AP ta usa un mekanismo di proteina spesialisá pa sali for di ER, nos a haña ku separashon dependiente di seramida C26 no ta dependé di interakshonnan diferensial di proteina ku por kondusí na spesialisashon di ERES (Figuranan S4 i S5). En bes di esei, nos resultadonan ta sostené un mekanismo di klasifikashon alternativo impulsá pa agrupashon di proteina basá riba lipid i eksklushon siguiente di otro karganan. Nos opservashonnan ta indiká ku e region òf klúster di Gas1-GFP asosiá ku un ERES spesífiko ta falta e proteina sekretá di transmembrana Mid2-iRFP, loke ta indiká ku e klúster di GPI-AP dependiente di seramida C26 lo fasilitá nan entrada den e ERES relevante, i na mes momento, ekskluí transmembrana E sekreshonnan ta drenta e ERES partikular aki (Figuranan 2 i RES). Na kontraste, e presensia di C18-C16 ceramides den e membrana di ER no ta kousa GPI-AP pa forma regionnan òf klústernan, pues nan no ta ekskluí òf remplasá proteinanan sekretá di transmembrana den e mesun ERES (Figuranan 3 i 4). . P’esei, nos ta proponé ku C26 ceramide ta impulsá separashon i klasifikashon dor di fasilitá e agrupashon di proteina ligá na ERES spesífiko.
Kon pa logra e agrupashon dependiente di seramida C26 aki den un área spesífiko di ER? E tendensia di seramida di membrana pa separá lateralmente por kousa GPI-AP i seramida C26 pa forma lipidonan chikitu i instantáneamente ordená den e ambiente di lipid mas iregular di e membrana ER ku ta kontené gliserolipidnan mas kòrtiku i insatura. Klústernan di kalidat (17, 18). E gruponan temporal chikitu aki por wòrdu fusioná mas aleu den gruponan mas grandi i mas stabil despues di mara na e kompleho p24 (34). Konsistente ku esaki, nos a mustra ku C26 Gas1-GFP mester interkambiá ku e kompleho p24 pa forma gruponan visibel mas grandi (Figura 3). E kompleho p24 ta un oligómero heterozigoto komponé di kuater diferente proteina transmembrana di p24 den yeast (35), ku ta proveé ​​union multivalente, ku por kondusí na cross-linking di klústernan chikitu di GPI-AP, generando asina klúster Stabil mas grandi (34). E interakshon entre e ektodominionan di proteina di GPI-APs tambe por kontribuí na nan agregashon, manera ta mustra durante nan transporte di Golgi den celnan epitelial polarisá di mamífero (36). Sinembargo, ora C18-C16 ceramide ta presente den e membrana di ER, ora e kompleho p24 ta mara na Gas1-GFP, gruponan grandi separá lo no wòrdu formá. E mekanismo subyacente por dependé di e propiedatnan físiko i kímiko spesífiko di e seramida di kadena largu di asil. Estudionan biofísiko di membrananan artifisial ta mustra ku ounke tantu seramida di kadena asil largu (C24) komo kòrtiku (C18-C16) por kousa separashon di fase, solamente seramida di kadena asil largu (C24) por promové kurvatura haltu i doblamentu di pelíkula pa remodela e pelíkula. Pa medio di referensia mutuo (17, 37, 38). A keda demostrá ku e héliks transmembrana di TMED2, e homólogo humano di Emp24, ta interkambiá selektivamente ku sfingomielina basá riba seramida C18 den e lóbulonan sitoplasmátiko (39). Usando simulashonnan di dinámika molekular (MD), nos a haña ku tantu seramida C18 komo C26 ta akumulá rònt di e lóbulonan sitoplasmátiko di e héliks transmembrana Emp24, i nan tin preferensia similar (Figura S6). Ta bon pa menshoná ku esaki ta indiká ku e héliks transmembrana di Emp24 por kondusí na distribushon asimétriko di lipidonan den e membrana. Esaki ta un resultado resien basá riba sèlnan di mamífero. Simulashonnan di MD similar tambe ta mustra e presensia di lipidonan di éter (40) . P’esei, nos ta spekulá ku C26 ceramide den e dos lóbulonan di ER26 ta enrikesé lokalmente. Ora GPI-AP den e lóbulonan luminal ta mara direktamente na p24 multivalente i e akumulamentu di seramida C26 rònt di p24 den e lóbulonan sitoplasmátiko, e por promové e agregashon di proteina i kurvatura di membrana ku ta kompañá ta wòrdu generá a traves di e dedenan (41), kousando GPI-AP pa separá den regionnan diskreto banda di ERES, ku tambe ta faboresé e regionnan haltu di ERES e membrana di ER (42). Rapòrtnan anterior a sostené e mekanismo proponé (43, 44). E union multivalente di oligolektina, patógeno òf antikurpanan na glikosfingolipidonan basá riba seramida (GSL) riba e membrana di plasma ta kousa agregashon grandi di GSL, ta mehorá separashon di fase i ta kousa deformashon i internalisashon di membrana (44). Iwabuchi etc. (43) A haña ku den presensia di kadenanan asil largu (C24) pero no kòrtiku (C16), e ligando multivalente mará na GSL lactosylceramide a indusí e formashon di klústernan grandi i invaginashon di membrana, i e transdukshon di señal media pa Lyn di e sitoplasma riba e foyetonan ta wòrdu interdigitá pa kadenanan neutrofil den parehanan neutrofil.
Den celnan epitelial polarisá di mamífero, e konsentrashon di e ret anti-Golgi (TGN) te na e nivel di e membrana di plasma apikal ta kontrolá e separashon i klasifikashon di GPI-AP (10, 45). E agregashon aki ta wòrdu impulsá pa oligomerisashon di GPI-AP (36), pero e por dependé tambe di e largura di e kadena di seramida ku nos ta haña den ist. Aunke GPI-AP di mamífero tin un anker basá riba lipid di éter, i su struktura kímiko ta hopi diferente for di e seramida di kadena di asil hopi largu, un estudio resien a haña ku tur dos lipid tin propiedatnan i funshon físiko i kímiko evolutivamente similar (40). P’esei, e parti di lipido di eter den celnan di mamífero por ta similar na e seramida C26 den ist, i su ròl ta pa asosiá ku e seramida di kadena largu den e membrana pa promové agregashon i klasifikashon di GPI-AP. Aunke e posibilidat aki mester wòrdu tèst direktamente ainda, resultadonan anterior ta sostené ku e transporte di e seramida di kadena largu di asil pa e kurpa di Golgi no ta wòrdu hibá afó dor di proteinanan di transferensia sitoplasmátiko, pero ta dependé di e síntesis di ankernan di GPI manera ist. P’esei, e mekanismo konservativo evolutivo ta parse di por ko-transportá selektivamente seramida di kadena asil hopi largu i GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) den e mesun vesikula di transporte.
Den sistemanan di sèl epitelial polarisá di ist i mamífero, agregashon i separashon di GPI-AP for di otro proteinanan di membrana di plasma tur ta sosodé promé ku yega na e superfisie di sèl. Paladino et al. (48) a haña ku riba e TGN di celnan epitelial polarisá di mamífero, agrupashon di GPI-AP no solamente ta nesesario pa e klasifikashon selektivo di GPI-AP pa e membrana di plasma apikal, pero tambe ta regulá e organisashon di agrupashon di GPI-AP i Su aktividat biológiko. Superfisie di cel. Den ist, e estudio aki a mustra ku e grupo di GPI-AP dependiente di seramida C26 riba e ER por regulá e organisashon di grupo i aktividat funshonal di GPI-AP riba e membrana di plasma (24, 49). Konsistente ku e modelo aki, sèlnan GhLag1 ta alérgiko na inhibidornan di GPI òf remedinan ku ta afektá integridat di muraya di cel (28), i e nesesidat pa gruponan funshonal di Gas1-GFP (49) di e seramida di punta proyektá den e parehamentu di sèlnan di ist ta indiká G Posibel konsekuensianan fisiológiko di sèlnan hLag1. Eror di GPI-AP. Sinembargo, mas prueba si e organisashon funshonal di e superfisie di cel a wòrdu programá for di e ER dor di un método di sorteo basá riba largura di lípido lo ta e tema di nos investigashon den futuro.
E strainnan di Saccharomyces cerevisiae ku a wòrdu usá den e trabou aki ta lista den Tabel S1. E strainnan MMY1583 i MMY1635 di SCLIM pa imágen di sèl bibu a wòrdu konstruí den e fondo di W303. E strainnan aki ku ta ekspresá Sec13-mCherry ku un tag di proteina fluoresente a wòrdu konstruí usando un método basá riba reakshon di kadena di polimerasa (PCR) ku plasmido pFA6a komo un plantilla (23). E strain ku ta ekspresá Mid2-iRFP marká ku proteina fluoresente bou di e kòntròl di e promotor GAL1 a wòrdu konstruí di e siguiente manera. Amplifikashon di PCR di sekuensia di iRFP-KanMx for di vektor di pKTiRFP-KAN (regalo di E. O’Shea, number di plasmido di Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identifikadó di rekurso di investigashon (RRID): Addgene_64687) I insertá den e endón-termino di C.2. Despues ku e sekuensia di genoma Mid2-iRFP a wòrdu amplifiká i klon den e promotor GAL1, el a wòrdu integrá den e sitio Not I-Sac I di e plasmido di integrashon pRS306. E plasmido pRGS7 resultante a wòrdu linearisá ku Pst I pa integrá den e lokus URA3.
E gene di fushon Gas1-GFP ta wòrdu ekspresá bou di e kòntròl di e promotor GAL1 den e plasmido di sentromero (CEN), ku ta wòrdu konstruí di e siguiente manera. E sekuensia di Gas1-GFP a wòrdu amplifiká pa PCR for di e plasmido pRS416-GAS1-GFP (24) (regalo di L. Popolo) i klon den e sitio Xma I–Xho I di e plasmido CEN pBEVY-GL LEU2 (regalo di C) . Miller; Number di plasmido di Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). E plasmid resultante a haña e nòmber pRGS6. E gene di fushon Axl2-GFP tambe ta wòrdu ekspresá bou di e kòntròl di e promotor GAL1 di e vektor pBEVY-GL LEU2, i su konstrukshon ta lo siguiente. E sekuensia Axl2-GFP a wòrdu amplifiká for di pRS304-p2HSE-Axl2-GFP plasmid (23) pa medio di PCR, i klon den e sitio Bam HI-Pst I di vektor pBEVY-GL LEU2. E plasmid resultante a haña e nòmber pRGS12. E sekuensia di e oligonukleotidonan usá den e estudio aki ta lista den Tabel S2.
E strain a wòrdu suplementá ku 0.2% di adenina i 2% di glukosa [YP-dextrose (YPD)], 2% di rafinosa [YP-raffinosa] riku na ekstrakto di yeast di proteina p (YP) medio (1 % di ekstrakto di yeast i 2% di proteina ept). (YPR)] òf 2% galaktosa [YP-galaktosa (YPG)] komo un fuente di karbon, òf den un medio mínimo sintétiko (0.15% base di nitrógeno di yeast i 0.5% sulfato di amonio) pa suplementá aminoácidonan i basenan apropiá nesesario pa nutrishon , I ku ta kontené 2% di glukosa (medio mínimo di glukosa) òf medio mínimo galaktosa (medio mínimo di galaktosa sintétiko) komo un fuente di karbon.
Pa imágen den tempu real, sèlnan mutante sec31-1 sensitivo na temperatura ku ta ekspresá e konstrukshon bou di e promotor GAL1 a wòrdu kultivá den medio YPR na 24°C durante anochi te na fase mid-log. Despues di indukshon den YPG na 24°C pa 1 ora, e sèlnan a wòrdu inkubá den SG na 37°C pa 30 minüt, i despues a wòrdu transferí pa 24°C pa liberá for di e blòki di sekreshon. Concanavalin A a wòrdu usá pa fiha e sèlnan riba un slide di glas i a wòrdu imágen pa SCLIM. SCLIM ta un kombinashon di mikroskop di fluorescencia invertí Olympus IX-71 i lens di zeta di apertura numeriko UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), skan konfokal di disko rotativo di velosidat haltu i di relashon haltu di señal pa zonido (Yokogawa Electric), spektrometer personalisá, imágennan di imágen di intensifikashon di spektrometer personalisá (Hamamatsu Photonics) por proveé ​​un sistema di lens di magnifikashon ku un magnifikashon final di ×266.7 i un kámara di aparato ku ta konektá ku karga ku ta multipliká elektrón (Hamamatsu Photonics) (21). Atkisishon di imágen ta wòrdu realisá dor di software personalisá (Yokogawa Electric). Pa imágennan 3D, nos a usa un aktuadó piezoeléktriko trahá na midí pa vibrá e lens di ophetivo vertikalmente, i a rekohé e partinan optiko 100 nm for di otro den un stapel. E imágen di Z-stack ta wòrdu kombertí den dato di voxel 3D, i e funshon di plamamentu di punto teóriko ku ta wòrdu usá pa e mikroskop konfokal di disko rotativo ta wòrdu usá pa prosesamentu di dekonvolushon dor di software Volocity (PerkinElmer). Dor di usa software di Volocity pa un drempel outomatikamente pa analisis di ko-lokashon, a midi ERES inkluyendo karga. Análisis di skan di liña a wòrdu realisá usando software MetaMorph (Aparatonan Molekular).
Usa e software GraphPad Prism pa determiná nifikashon estadístiko. Pa e t-test di Student di dos rabo i e tèst di analisis di variashon di un solo kaminda (ANOVA), diferensianan entre gruponan ta wòrdu konsiderá pa tin un impakto signifikante riba P <0.05 (*).
Pa mikroskopia di fluorescencia di Gas1-GFP, e sèlnan di fase log a wòrdu krese durante anochi den YPD i rekohé pa medio di sentrifugashon, labá dos biaha ku salina buffer ku fosfato, i inkubá riba ijs pa por lo ménos 15 minüt, i despues a sigui bou di e mikroskopio manera deskribí anteriormente Check (24). E mikroskop Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) ekipá ku un lens di ophetivo, filter L5 (GFP), kámara Hamamatsu i software di Application Suite X (LAS X) a wòrdu usá pa atkisishon. .
E muestranan a wòrdu desnaturá ku un buffer di muestra di SDS na 65°C pa 10 minüt, i despues a wòrdu separá pa elektroforesis di gel di SDS-poliakrilamida (PAGE). Pa analisis di imunoblotting, 10 μl di muestra a wòrdu kargá pa kada liña. Antikurpa primario: Usa anti-Gas1 poliklonal di konènchi na un dilushon di 1:3000, anti-Emp24 poliklonal di konènchi na un dilushon di 1:500, i anti-GFP poliklonal di konènchi (un regalo di H. Riezman) na un dilushon di 1:3000. E antikurpa anti-Pgk1 monoklonal di raton a wòrdu usá na un dilushon di 1:5000 (un regalo di J. de la Cruz). Antikurpa sekundario: Horseradish peroxidase (HRP) konhugá di kabritu anti-konèn imunoglobulina G (IgG) usá na un dilushon di 1:3000 (Pierce). IgG anti-raton di kabritu konhohá ku HRP a wòrdu usá na un dilushon di 1:3000 (Pierce). E zona di kontesta inmunológiko a wòrdu opservá dor di e método di kimiluminisensia di e reaktivo SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Manera deskribí den (31), un eksperimento di imunopresipitashon natural a wòrdu realisá riba e frakshon di ER enrikesé. Den kòrtiku, laba e sèlnan di ist ku TNE buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride i meskla di inhibidor di proteasa) na 600 nm ( OD600) na 100 densidat optiko dos biaha. El a wòrdu kibra ku kralchi di glas, i despues e desperdisio di cel i kralchi di glas a wòrdu kita dor di sentrifugashon. E supernatante despues a wòrdu sentrifugá na 17.000 g pa 15 minüt na 4°C. E pèlèt a wòrdu resuspendé den TNE i digitalis saponin a wòrdu agregá na un konsentrashon final di 1%. E suspenshon a wòrdu inkubá pa 1 ora ku rotashon na 4°C, i despues e komponentenan insolubel a wòrdu kita dor di sentrifugashon na 13.000 g na 4°C pa 60 minüt. Pa imunopresipitashon di Gas1-GFP, promé pre-inkubá e muestra ku grano di agarosa bashi (ChromoTek) na 4°C pa 1 ora, i despues inkubá ku GFP-Trap_A (ChromoTek) na 4°C pa 3 ora. E bòternan imunopresipitá a wòrdu labá sinku biaha ku TNE ku ta kontené 0.2% digoxigenin, eluí ku buffer di muestra di SDS, separá riba SDS-PAGE, i analisá pa medio di immunoblotting.
Manera deskribí den (31), determinashon di cross-linking a wòrdu realisá riba e frakshon di ER enrikesé. Brevemente, e frakshon di ER enrikesé a wòrdu inkubá ku 0.5 mM dithiobis(succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, Merka; 20°C, 20 min). E reakshon di retikulashon a wòrdu apagá dor di agregá glisina (konsentrashon final di 50 mM, 5 minüt, 20°C).
Manera deskribí anteriormente (50), a realisá analisis di MS di seramida den tipo salbahe i GhLag1. Den kòrtiku, e sèlnan a wòrdu krese te na fase eksponensial (3 pa 4 OD600 unidat/ml) den YPD na 30°C, i 25×107 sèl a wòrdu kosechá. Nan metabolismo ta wòrdu apagá ku asido trikloroasétiko. Usa solvente di ekstrakshon [etanol, awa, éter, piridina i 4.2 N hidróxido di amonio (15:15:5:1:0.018 v/v)] i 1.2 nmol di kalidat di seramida C17 standart interno (860517, lipid polar Avanti)). Usa reaktivo di monometilamina [metanol, awa, n-butanol i solushon di metilamina (4:3:1:5 v/v)] pa hasi hidrolisis alkalino leve di e ekstrakto, i despues usa n-butanol saturá ku awa pa desalitá. Finalmente, e ekstrakto a wòrdu resuspendé den un solvente di moda positivo [kloroformo/metanol/awa (2:7:1) + 5 mM asetato di amonio] i inyektá den e spektrómeter di masa. Monitoreo multi-reashon (MRM) a wòrdu realisá pa identifikashon i kuantifikashon di molèkülnan di sfingolipid. E spektrometer di masa di kuadrupolo tersiario TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) ta ekipá ku un fuente di ion di nanofluho robótiko Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) pa analisis di lipid. E energia di kolishon ta optimalisá pa kada kategoria di seramida. Datonan di MS a wòrdu optené den moda positivo. Pa kada replika biológiko, e señal di lipid ta e mediano di tres midimentu independiente.
Manera deskribí den (31), e sèlnan (800×107) ku ta ekspresá Gas1-GFP a wòrdu sometí na imunopresipitashon natural. E Gas1-GFP purifiká a wòrdu separá pa SDS-PAGE i transferí pa un membrana di fluor di polivinilideno (PVDF). E proteina a wòrdu visualisá dor di mancha PVDF ku amida pretu. E banda di Gas1-GFP a wòrdu kòrtá for di e PVDF i labá 5 biaha ku metanol i un biaha ku awa di grado kromatografia líkido-MS (LC-MS). Dor di inkubá e strip di membrana ku 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), buffer i 500μl di meskla di nitrito di sodio 1 M fresku disolvé na 37°C pa 3 ora, e frakshon di lípido ta wòrdu liberá for di Gas1-GFP i ta wòrdu lisá Liberashon di infofosofamina den gluteofamina i seramina (51). Despues di esei, e strip di membrana a wòrdu labá kuater biaha ku awa di grado LC-MS, seku na temperatura di kamber, i warda den un atmósfera di nitrógeno na -80°C te ora di analisis. Komo un kòntròl, un muestra blanku di membrana di PVDF a wòrdu usá pa kada eksperimento. E lipido ekstraí for di Gas1-GFP despues a wòrdu analisá pa MS manera deskribí (50). Den kòrtiku, stripnan di PVDF ku ta kontené GPI-lipid a wòrdu resuspendé den 75μl di solvente di molde negativo [kloroformo/metanol (1:2) + 5 mM asetat di amonio] i a pasa electrospray ionization (ESI)-MRM/MS Analysis of sphingolipid species (TSQ Vantage). Den e kaso aki, datonan di MS a wòrdu optené den moda di ion negativo.
Manera menshoná anteriormente, e porshon di lipid di e anker di GPI a wòrdu separá for di e GPI-AP marká ku [3H]-inositol (16). E lipidonan a wòrdu separá pa medio di kromatografia di kapa fini usando un sistema di solvente (55:45:10 chloroform-methanol-0.25% KCl) i visualisá usando FLA-7000 (Fujifilm).
E sèlnan ku ta ekspresá Gas1-GFP (600×107) a wòrdu labá dos biaha ku tampón di TNE ku tampón di TNE, i kibra ku grano di glas, i despues sentrifugá pa kita debris di cel i grano di glas. E supernatante despues a wòrdu sentrifugá na 17.000 g pa 1 ora na 4°C. E pèlèt a wòrdu labá den TNE i inkubá ku 1 U PI-PLC (Invitrogen) den TNE ku ta kontené 0.2% digitalis saponin pa 1 ora na 37°C. Despues di e tratamentu di enzima, e membrana a wòrdu kita dor di sentrifugashon na 17.000 g na 4°C pa 1 ora. Pa imunopresipitá Gas1-GFP, e supernatante a wòrdu inkubá ku GFP-Trap_A (ChromoTek) na 4°C durante anochi. E Gas1-GFP purifiká separá pa SDS-PAGE a wòrdu mancha ku blou briante di Coomassie. E banda di manchamentu di Gas1-GFP a wòrdu kòrtá for di e gris rònt di e akuedukto, i despues despues di alkilashon ku iodoacetamide i redukshon ku ditiothreitol, a hasi digestion den gel ku tripsina. Ekstraé i seku peptidonan triptiko i peptidonan ku GPI-glikan. E peptide seku a wòrdu disolvé den 20 μl di awa. Inyektá un porshon (8μl) den e LC. Un kolumna di octadecylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diameter interno 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Prefektura di Aichi, Hapon) a wòrdu usá pa separá peptidenan bou di kondishonnan di gradiente spesífiko. E fase móbil ta solvente A (0.08% asido fórmiko) i solvente B (0.15% asido fórmiko den 80% asetonitrilo). Un sistema di Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) a wòrdu usá pa eluí e kolumna ku solvente A denter di 55 minüt na un fluho di 50 μl min-1 pa 5 minüt, i despues e konsentrashon di solvente B a wòrdu oumentá na 40%. , Merka). E eluato a wòrdu introdusí kontinuamente den e fuente di ion ESI, i e peptidenan tríptiko i peptidenan ku GPI-glycans a wòrdu analisá pa LTQ Orbitrap XL (spektrometer di masa trapa-orbitrap di ion linear híbrido; Thermo Fisher Scientific). Den e setup di MS, e voltahe di e fuente kapilar a wòrdu fihá na 4.5 kV, i e temperatura di e kapilar di transferensia a keda na 300°C. E voltahe kapilar i voltahe di lens di tubo a wòrdu fihá na 15 V i 50 V, respektivamente. E datonan di MS a wòrdu optené den e modo di ion positivo (resolushon di 60.000; eksaktitut di masa di 10 parti pa mion) den un rango di masa di 300/m/z relashon di masa/karga (m/z) 3000. E datonan di MS/MS ta wòrdu optené a traves di e trampa di ion den e LTQ Orbit [XL, e datonan promé ku e datonan ta dependé di dje promé disosiashon indusí pa kolishon (CID)].
Simulashonnan di MD a wòrdu realisá usando software GROMACS (52) i kampo di forsa MARTINI 2 (53-55). E CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) despues a wòrdu usá pa konstruí un bilayer ku ta kontené dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) i Cer C18 òf DOPC i Cer C26. E topologia i koordinatnan di Cer C26 ta derivá for di DXCE dor di kita e kralnan èkstra for di e rabo di sfingosina. Usa e proseso deskribí abou pa balansá e kapa dòbel i kore esaki, despues usa e último koordinatnan di e sistema pa konstruí un sistema ku ta kontené Emp24. E dominio transmembrana di yeast Emp24 (residuonan 173 pa 193) a wòrdu konstruí komo un α-helix usando e struktura molekular di e herment visual MD (VMD) (58). Despues, despues di a kita e lipidonan ku ta overlap, e proteina a wòrdu granulá brutu i insertá den e kapa usando CHARMM GUI. E sistema final ta kontené 1202 DOPC i 302 Cer C26 òf 1197 DOPC i 295 Cer C18 i Emp24. Ionisa e sistema na un konsentrashon di 0.150M. Kuater replika independiente a wòrdu trahá pa dos komposishon di dos kapa.
E kapa di lipid ta wòrdu balansá usando e proseso di CHARMM GUI, ku ta enserá minimalisá i despues balansá 405.000 paso, kaminda e limitashonnan di posishon ta wòrdu redusí i eliminá gradualmente, i e paso di tempu ta wòrdu oumentá di 0.005 ps pa 0.02 ps. Despues di ekilibrashon, e ta produsí 6 μs ku un paso di tempu di 0.02 ps. Despues di insertá Emp24, usa e mesun proseso di CHARMM GUI pa minimalisá i balansá e sistema, i despues kore pa 8 s den produkshon.
Pa tur sistema, durante e proseso di balansa, e preshon ta wòrdu kontrolá dor di e barostat di Berendsen (59), i durante e proseso di produkshon, e preshon ta wòrdu kontrolá pa e barostat di Parrinello-Rahman (60). Den tur kaso, e preshon promedio ta 1 bar i un skema di koupling di preshon semi-isotrópiko ta wòrdu usá. Den e proseso di balansa i produkshon, un termostaat (61) ku rekalibrashon di velosidat ta wòrdu usá pa konektá e temperatura di partikulonan di proteina, lípido i solvente respektivamente. Durante henter e operashon, e temperatura di meta ta 310K. E interakshon no-bonding ta wòrdu kalkulá dor di generá un lista di pareha usando e skema di Verlet ku toleransia di buffer di 0.005. E término di Coulomb ta wòrdu kalkulá usando e kampo di reakshon i un distansia di kòrtamentu di 1.1 nm. E término di Vander Waals ta usa un skema di kòrtamentu ku un distansia di kòrtamentu di 1.1 nm, i e skema di kòrtamentu di Verlet ta wòrdu usá pa drift potensial (62).
Usando VMD, e largura di ola di kòrtamentu entre e kralchi di fosfato di DOPC òf kralchi di seramida AM1 i e proteina ta 0.7 nm, i e kantidat di lipidonan ku ta interkambiá ku e proteina ta wòrdu kalkulá. Di akuerdo ku e siguiente fórmula, kalkulá e faktor di agotamentu-enrikesimentu (DE) manera den (63): Faktor DE = (e kantidat di lípido total den e proteina 0.7) den e proteina 0.7 (e kantidat di Cer den lípido total)
E balor raportá ta wòrdu optené komo un promedio, i e barnan di eror ta kuater kopia independiente di SE. E nifikashon estadístiko di e faktor DE ta wòrdu kalkulá dor di t test [(averageDE-factor-1)/SE]. Kalkulá e balor di P for di e distribushon di un rabo.
E herment GROMACS a wòrdu usá pa kalkulá e mapa di densidat lateral 2D di e sistema ku ta kontené Emp24 denter di e último 250 ns di e tras. Pa por optené e mapa di enrikesimentu/agotamentu di seramida, e mapa di densidat di Cer ta wòrdu dividí pa e suma di e mapa di Cer i DOPC, i despues dividí pa e konsentrashon di Cer den e kurpa. E mesun eskala di mapa di koló ta wòrdu usá.
Pa materialnan suplementario pa e artíkulo aki, por fabor wak http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
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Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lingio Sererope), Wazerhope (Serhope) (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Imágennan 3D di resolushon haltu den tempu real ta revelá e importansia di largura di kadena di seramida pa klasifikashon di proteina den sitionan di salida selektivo.
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