Presente *Adres aktual: Cologne 50931, Alemania, Investigashon di Klúster di Ekselensia di Cologne riba Respuesta na Stress Selular den Malesanan Relashoná ku Envehesimentu (CECAD).
E neurodegenerashon di malesanan mitokondria ta wòrdu konsiderá ireversibel pasobra e plastisidat metabóliko di neuronnan ta limitá, pero e efekto di disfunshon mitokondria riba e outonomia celular di metabolismo neuronal den e kurpa ta mal komprondé. Aki, nos ta introdusí e proteoma spesífiko di cel di neuronnan di Purkinje ku defisiensia progresivo di OXPHOS kousa pa dinámika di fushon mitokondrial strobá. Nos a haña ku disfunshon mitokondrial a kousa un kambio profundo den e tereno di proteómika, ku na final a kondusí na e aktivashon sekuensial di programanan metabóliko presis promé ku morto di cel. Inesperadamente, nos a determiná e indukshon opvio di piruvato karboksilasa (PCx) i otro peroxidasanan relashoná ku suplementashon di e intermediarionan di e siklo di TCA. E inhibishon di PCx a eksaserbá strès oxidativo i neurodegenerashon, indikando ku aterosklerosis tin un efekto protektivo den neuronnan ku no tin OXPHOS. E restourashon di fushon mitokondrial den neuronnan degenerá terminalmente ta invertí kompletamente e karakterístikanan metabóliko aki, preveniendo asina morto di cel. Nos resultadonan ta identifiká trayektonan deskonosí anteriormente ku ta duna resiliensia na disfunshon mitokondrial i ta mustra ku neurodegenerashon por wòrdu reversá asta den e fasenan lat di e malesa.
E ròl sentral di mitokondria den mantenshon di metabolismo di energia neuronal ta wòrdu enfatisá dor di e síntomanan neurolóhiko ekstenso asosiá ku malesanan mitokondria humano. Mayoria di e malesanan aki ta wòrdu kousa pa mutashonnan di gene ku ta regulá ekspreshon di gene mitokondria (1, 2) òf destrukshon di gene relashoná ku dinámika mitokondria, ku ta afektá indirektamente e stabilidat di DNA mitokondria (mtDNA) (3, 4). Trabou den modelonan animal a mustra ku komo kontesta na disfunshon mitokondrial den e tehidonan rondó, trayektonan metabóliko konservativo (5-7) por wòrdu aktivá, dunando asina bista importante riba e patogénesis di e malesanan kompleho aki. Na kontraste fuerte, nos komprondementu di e kambionan metabóliko di tiponan di cel spesífiko kousa pa e fayo general di produkshon di adenosina trifosfato (ATP) mitokondrial di selebro ta fundamental (8), enfatisando e nesesidat pa identifiká metanan terapéutiko ku por wòrdu usá pa prevení òf prevení malesa. Prevení neurodegenerashon (9). E falta di informashon ta e echo ku sèlnan di nervio ta wòrdu konsiderá ampliamente pa tin fleksibilidat metabóliko hopi limitá kompará ku e tiponan di sèl di e tehidonan rondó (10). Konsiderando ku e sèlnan aki ta hunga un ròl sentral den kordinashon di e suministro di metabolitonan na neuronnan pa promové transmishon sináptiko i respondé na kondishonnan di leshon i malesa, e abilidat pa adaptá metabolismo di sèl na e kondishonnan difísil di e tehido di selebro ta kasi limitá na sèlnan glial (11-14). Ademas, e heterogenidat selular inherente di e tehido di selebro ta stroba pa gran parti e estudio di kambionan metabóliko ku ta sosodé den subgruponan neuronal spesífiko. Komo resultado, poko ta konosí tokante e konsekuensianan eksakto selular i metabóliko di disfunshon mitokondrial den neuronnan.
Pa por komprondé e konsekuensianan metabóliko di disfunshon mitokondrial, nos a isolá neuronan di Purkinje (PN) den diferente etapa di neurodegenerashon kousa pa e destrukshon di fushon di membrana eksterno mitokondrial (Mfn2). Aunke mutashonnan di Mfn2 den hende ta asosiá ku un forma di neuropatia sensorial motoriko hereditario konosí komo Charcot-Marie-Tooth tipo 2A (15), e destrukshon kondishonal di Mfn2 den raton ta un método di disfunshon di indukshon di oksidashon (OXPHOS) bon rekonosé. E vários subtiponan neuronal (16-19) i e fenotipo neurodegenerativo resultante ta kompañá pa síntomanan neurológiko progresivo, manera trastornonan di moveshon (18, 19) òf ataxia serebelar (16). Dor di usa un kombinashon di proteómika kuantitativo sin etiketa (LFQ), metabolómika, imágen i métodonan virológiko, nos ta mustra ku neurodegenerashon progresivo ta indusí fuertemente piruvato karboksilasa (PCx) i otro faktornan enbolbí den arteriosklerosis di PN in vivo E ekspreshon di enzimanan. Pa verifiká e relevansia di e resultado aki, nos a regulá spesífikamente e ekspreshon di PCx den PNnan ku defisiensia di Mfn2, i a haña ku e operashon aki a agravá strès oxidativo i a aselerá neurodegenerashon, probando asina ku azoospermia ta konferí morto di cel Adaptabilidat metabóliko. Ekspreshon severo di MFN2 por reskatá kompletamente e degenerashon terminal PN ku defisiensia severo di OXPHOS, konsumo masivo di DNA mitokondria, i aparentemente ret mitokondria kibra, loke ta enfatisá mas aleu ku e forma aki di neurodegenerashon por asta rekuperá den e fase avansá di malesa promé ku morto di cel.
Pa por visualisá e mitokondria den Mfn2 knockout PNs, nos a usa un strain di raton ku ta permití mitokondria dependiente di Cre pa dirigí riba ekspreshon di proteina fluorescente geel (YFP) (mtYFP) (20) Cre i a kontrolá e morfologia di mitokondria in vivo. Nos a haña ku e destrukshon di e gene Mfn2 den PNs lo a kondusí na e divishon gradual di e ret mitokondrial (Figura S1A), i e kambio mas trempan a wòrdu hañá na 3 siman di edat. Na kontraste, e degenerashon supstansial di e kapa di sèl PN, manera ta wòrdu demostrá pa e pèrdida di imunokolor di Calbindin, no a kuminsá te ku 12 siman di edat (Figura 1, A i B). E desakuerdo di tempu entre e kambionan mas trempan den morfologia mitokondria i e inisio visibel di morto neuronal a pone nos investigá e kambionan metabóliko kousa pa disfunshon mitokondria promé ku morto di cel. Nos a desaroyá un strategia basá riba klasifikashon di sèl aktivá pa fluorescencia (FACS) pa isolá PN ku ta ekspresá YFP (YFP+) (Figura 1C), i den ratonnan di kòntròl (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), aki despues referí na dje komo CTRL (Figura S1B). E optimalisashon di e strategia di gating basá riba e intensidat relativo di e señal di YFP ta permití nos purifiká e kurpa YFP+ (YFPhigh) di PN for di no-PN (YFPneg) (Figura S1B) òf fragmentonan di akson/dendrítiko fluorescente putativo (YFPlow; Figura S1D, robes), konfirmá pa mikroskopio konfokal (Figura S1D, drechi). Pa por verifiká e identidat di e poblashon klasifiká, nos a kondusí proteómika LFQ i despues analisis di komponente prinsipal, i a haña ku tin un separashon kla entre celnan YFPhigh i YFPneg (Figura S1C). Sèlnan YFPhigh a mustra un enrikesimentu nèt di markadónan konosí di PNs (p.e. Calb1, Pcp2, Grid2 i Itpr3) (21, 22), pero no enrikesimentu di proteinanan komunmente ekspresá den neuron òf otro tipo di sèl (Figura 1D) ). Un komparashon entre muestranan den celnan YFPhigh klasifiká rekohé den eksperimentonan independiente a mustra un koefisiente di korelashon> 0.9, demostrando bon reprodusibilidat entre replikanan biológiko (Figura S1E). Den resumen, e datonan aki a validá nos plan pa isolashon agudo i spesífiko di PN posibel. Debí ku e sistema di driver L7-cre usá ta indusí rekombinashon di mosaiko den e promé siman despues di parto (23), nos a kuminsá mata ratonnan for di CTRL i kondishonal (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Kolekshoná neuronnan. Despues ku e rekombinashon ta kompletá, e ta wòrdu yamá Mfn2cKO na 4 siman di edat. Komo e punto final, nos a selektá 8 siman di edat ora e kapa di PN tabata intakto ainda apesar di e fragmentonan mitokondrial opvio (Figura 1B i Figura S1A). En total, nos a kalkulá un total di 3013 proteina, di kua mas o ménos 22% tabata basá riba anotashonnan di MitoCarta 2.0 basá riba e proteoma mitokondria komo mitokondria (Figura 1E) (Figura 1E) (24). E analisis di ekspreshon di gene diferensial realisá na siman 8 a mustra ku solamente 10.5% di tur proteina tabatin kambionan signifikante (Figura 1F i Figura S1F), di kua 195 proteina tabata down-regulated i 120 proteina tabata up-regulated (Figura 1F). Ta bon pa menshoná ku e “análisis di trayekto inovativo” di e sèt di dato aki ta mustra ku e genenan ekspresá diferensialmente ta pertenesé prinsipalmente na un sèt restringí di trayektonan metabóliko spesífiko (Figura 1G). Interesantemente, ounke e regulashon abou di trayektonan relashoná ku OXPHOS i señalisashon di kalsio ta konfirmá e indukshon di disfunshon mitokondria den PNnan ku defisiensia di fushon, otro kategorianan ku ta enbolbí prinsipalmente metabolismo di amino asido ta signifikantemente up-regulá, loke ta na liña ku e metabolismo ku ta sosodé den PNnan mitokondria. Rewiring ta konsistente. disfunshon.
(A) Potrètnan konfokal representativo di sekshonnan serebelar di ratonnan CTRL i Mfn2cKO ku ta mustra pèrdida progresivo di PN (calbindin, gris); núkleonan a wòrdu kontrasteñá ku DAPI. (B) Kuantifikashon di (A) (análisis di variashon di un solo kaminda, ***P<0.001; n = 4 pa 6 sirkulo di tres raton). (C) Fluho di trabou eksperimental. (D) Distribushon di mapa di kalor di markadónan spesífiko pa Purkinje (ariba) i otro tiponan di sèl (medio). (E) Diagram di Venn ku ta mustra e kantidat di proteina mitokondrial identifiká den e PN klasifiká. (F) Plot di volkan di proteinanan ekspresá diferensialmente den neuronnan Mfn2cKO na 8 siman (balor di kòrtamentu di signifikashon di 1.3). (G) E analisis di e trayekto di kreatividat ta mustra e sinku trayektonan di regulashon ariba (kòrá) i regulashon abou (blou) mas importante den e Mfn2cKO PN klasifiká komo 8 siman. E nivel di ekspreshon promedio di kada proteina detektá ta wòrdu mustra. Mapa di kalor di eskala di gris: balor di P ahusta. ns, no ta importante.
Datonan di proteómika a mustra ku e ekspreshon di proteina di komplehonan I, III i IV a baha gradualmente. Komplehonan I, III, i IV tur tabata kontené subunidatnan esensial kódifiká pa mtDNA, miéntras ku kompleho II, ku tabata solamente kódifiká pa nuklear, básikamente no tabata afektá (Figura 2A i Figura S2A). . Konsistente ku e resultadonan di proteómika, imunohistokímika di sekshonnan di tehido serebelar a mustra ku e nivel di subunidat di MTCO1 (subunidad 1 di sitokromo C oxidase mitokondrial) di kompleho IV den PN a baha gradualmente (Figura 2B). E subunidad Mtatp8 kodifiká pa mtDNA a keda signifikantemente redusí (Figura S2A), miéntras ku e nivel di estado konstante di e subunidat ATP sintase kodifiká pa nuklear a keda sin kambio, loke ta konsistente ku e kompleho F1 di subasamblahe di ATP sintase stabil konosí ora ekspreshon di mtDNA ta stabil. E formashon ta konsistente. Interumpí (7). Evaluashon di e nivel di mtDNA den e PNnan di Mfn2cKO ordená pa medio di reakshon di kadena di polimerasa den tempu real (qPCR) a konfirmá e bahada gradual den e kantidat di kopia di mtDNA. Kompará ku e grupo di kòntròl, na 8 siman di edat, solamente alrededor di 20% di e nivel di mtDNA a keda retené (Figura 2C). Konsistente ku e resultadonan aki, e manchamentu di mikroskopia konfokal di Mfn2cKO PNs pa detektá DNA ta mustra e konsumo dependiente di tempu di nukleotidenan mitokondrial (Figura 2D). Nos a haña ku solamente algun kandidato enbolbí den degradashon di proteina mitokondrial i kontesta na strès tabata up-regulá, inkluyendo Lonp1, Afg3l2 i Clpx, i faktornan di asamblea kompleho di OXPHOS. No a detektá kambionan signifikante den e nivelnan di proteina enbolbí den apoptosis (Figura S2B). Di mes manera, nos a haña ku e kanalnan di mitokondria i retíkulo endoplasmátiko enbolbí den transporte di kalsio tin solamente kambionan menor (Figura S2C). Ademas, e evaluashon di proteinanan relashoná ku outofagia no a haña kambionan signifikante, loke ta konsistente ku e indukshon visibel di outofagosoma opservá in vivo pa medio di imunohistokímika i mikroskopia di elektrón (Figura S3). Sinembargo, e disfunshon progresivo di OXPHOS den PNs ta kompañá pa kambionan mitokondrial ultrastruktural opvio. Por mira gruponan di mitokondria den e kurpanan di cel i palunan dendrítiko di Mfn2cKO PNs di edat 5 i 8 siman, i e struktura di membrana interno a pasa den kambionan profundo (Figura S4, A i B). Konsistente ku e kambionan ultrastruktural aki i un bahada signifikante den mtDNA, analisis di slicenan serebral agudo ku tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) a mustra ku e potensial di membrana mitokondrial den Mfn2cKO PNs tabata signifikantemente baha (Figura S4C).
(A) Análisis di kurso di tempu di e nivel di ekspreshon di e kompleho OXPHOS. Konsiderá solamente proteinanan ku P<0.05 na 8 siman (ANOVA di dos kaminda). Liña punteá: No tin ahuste kompará ku CTRL. (B) Robes: Un ehèmpel di un sekshon serebelar marká ku antikurpa anti-MTCO1 (bar di eskala, 20 μm). E área okupá pa kurpanan di sèl di Purkinje ta kubri pa koló hel. Na man drechi: Kuantifikashon di nivelnan di MTCO1 (análisis di variashon di un solo kaminda; n = 7 pa 20 sèl analisá for di tres raton). (C) Análisis di qPCR di kantidat di kopia di mtDNA den e PN ordená (análisis di variashon di un solo kaminda; n = 3 pa 7 raton). (D) Robes: Un ehèmpel di un slice serebelar marká ku un anti-DNA (bar di eskala, 20 μm). E área okupá pa kurpanan di sèl di Purkinje ta kubri pa koló hel. Na man drechi: Kuantifikashon di leshonnan di mtDNA (análisis di variashon di un solo kaminda; n = 5 pa 9 sèl di tres raton). (E) Un ehèmpel di un sekshon serebelar agudo ku ta mustra sèlnan mitoYFP + Purkinje (flecha) den un grabashon di klem di pleister di henter sèl. (F) Kuantifikashon di e kurva IV. (G) Grabashonnan representativo di inyekshon di koriente depolarisante den celnan di Purkinje CTRL i Mfn2cKO. Rastro di mas haltu: E promé pulso ku a lanta AP. Rastro di abou: Frekuensha máksimo di AP. (H) Kuantifikashon di entradanan spontáneo postsináptiko (sPSPs). E rastro di grabashon representativo i su relashon di zoom ta wòrdu mustra den (I). Análisis di variashon di un solo kaminda a analisá n = 5 pa 20 sèl di tres raton. Datonan ta wòrdu ekspresá komo promedio±SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Rastronan representativo di AP spontáneo registrá usando e modo di klem di pleister perforá. Rastro di mas haltu: Frekuensha máksimo di AP. Rastro di abou: zoom di un solo AP. (K) Kuantifika e frekuensha promedio i máksimo di AP segun (J). Prueba di Mann-Whitney; n = 5 sèl a wòrdu analisá for di kuater raton. Datonan ta wòrdu ekspresá komo promedio±SEM; no ta importante.
Daño opvio di OXPHOS a wòrdu detektá den e Mfn2cKO PN di 8 siman bieu, indikando ku e funshon fisiológiko di neuronan ta severamente abnormal. P’esei, nos a analisá e karakterístikanan eléktriko pasivo di neuronnan ku defisiensia di OXPHOS na 4 pa 5 siman i 7 pa 8 siman dor di hasi grabashonnan di klem di patch di henter sèl den slicenan serebelar agudo (Figura 2E). Inesperadamente, e potensial di membrana di sosiegu promedio i resistensia di entrada di neuronnan Mfn2cKO tabata similar na e kòntròl, ounke tabatin diferensianan sutil entre celnan (Tabela 1). Di mes manera, na 4 pa 5 siman di edat, no a haña kambionan signifikante den e relashon koriente-voltahe (kurva IV) (Figura 2F). Sinembargo, ningun neuron Mfn2cKO di 7 pa 8 siman bieu a sobrebibí e régimen IV (paso di hiperpolarisashon), indikando ku tin un sensitividat kla pa potensial di hiperpolarisashon den e fase lat aki. Na kontraste, den neuronnan Mfn2cKO, e korientenan depolarisadó ku ta kousa deskarganan di potensial di akshon ripitítivo (AP) ta bon tolerá, indikando ku nan patronchinan di deskarga general no ta signifikantemente diferente for di esnan di neuronnan di kòntròl di 8 siman bieu (Tabela 1 i Figura 2G). Di mes manera, e frekuensha i amplitut di korientenan postsináptiko spontáneo (sPSCs) tabata komparábel ku esnan di e grupo di kòntròl, i e frekuensha di susesonan a oumentá di 4 siman pa 5 siman pa 7 siman pa 8 siman ku un oumento similar (Figura 2, H i I). E periodo di madures sináptiko den PN (25). Resultadonan similar a wòrdu optené despues di pleisternan di PNs perforá. E konfigurashon aki ta prevení e posibel kompensashon di defektonan di ATP selular, manera por sosodé den grabashon di klem di pleister di henter e sèl. En partikular, e potensial di membrana di sosiegu i e frekuensha di disparo spontáneo di neuronnan Mfn2cKO no a wòrdu afektá (Figura 2, J i K). Den resumen, e resultadonan aki ta indiká ku PNnan ku disfunshon opvio di OXPHOS por trata ku patronchinan di deskarga di frekuensha haltu bon, indikando ku tin un mekanismo di kompensashon ku ta permití nan mantené kontesta elektrofisiológiko kasi normal.
Datonan ta wòrdu ekspresá komo promedio ± SEM (análisis di variashon di un solo kaminda, tèst di komparashon múltiple di Holm-Sidak; *P<0.05). E number di unidat ta wòrdu indiká pa paréntesis.
Nos a kuminsá investigá si kualke kategoria den e sèt di dato di proteómika (Figura 1G) ta inkluí trayektonan ku por kontrarestá defisiensia severo di OXPHOS, splikando asina dikon PN afektá por mantené elektrofisiologia kasi normal (Figura 2, E pa K). . Análisis di proteómika a mustra ku e enzimanan enbolbí den e katabolismo di amino asidonan di kadena ramifiká (BCAA) tabata signifikantemente up-regulá (Figura 3A i Figura S5A), i e produkto final acetyl-CoA (CoA) òf succinyl CoA por suplementá e trikarboksilatonan den e siklo di arteriosklerosis Acid (TCA). Nos a haña ku e kontenido di BCAA transaminase 1 (BCAT1) i BCAT2 tur dos a oumentá. Nan a katalisá e promé paso di katabolismo di BCAA dor di generá glutamato for di α-ketoglutarate (26). Tur subunidad ku ta forma e kompleho di kadena ramifiká keto asido dehidrogenasa (BCKD) ta wòrdu regulá (e kompleho ta katalisá e dekarboksilashon siguiente i ireversibel di e skelet di karbon BCAA resultante) (Figura 3A i Figura S5A). Sinembargo, no a haña kambionan opvio den BCAA mes den e PN ordená, loke por ta debí na e oumento di e absorshon selular di e amino asidonan esensial aki òf e uso di otro fuentenan (glukosa òf asido láktiko) pa suplementá e siklo di TCA (Figura S5B). PNnan ku no tin OXPHOS tambe a mustra aktividatnan di deskomposishon i transaminashon di glutamina oumentá na 8 siman di edat, loke por wòrdu reflehá dor di e up-regulashon di e enzimanan mitokondrial glutaminase (GLS) i glutamine pyruvate transaminase 2 (GPT2) (Figura 3, A i C). Ta bon pa menshoná ku e up-regulashon di GLS ta limitá na e isoform glutaminase C spliced ​​(GLS-GAC) (e kambio di Mfn2cKO/CTRL ta aproksimadamente 4.5-biaha, P = 0.05), i su up-regulashon spesífiko den tehidonan di kanser Por sostené bioenergia mitokondrial. (27).
(A) E mapa di kalor ta mustra e kambio di plegamentu den nivel di proteina pa e ruta spesifiká na 8 siman. (B) Ehèmpel di un slice serebelar marká ku anti-PCx anti-PCx (bar di eskala, 20 μm). E flecha hel ta mustra riba e kurpa di e sèl di Purkinje. (C) Análisis di ekspreshon di proteina di kurso di tempu identifiká komo un kandidato importante pa aterosklerosis (t-test múltiple, *FDR <5%; n = 3-5 raton). (D) Ariba: Un diagram skemátiko ku ta mustra e diferente maneranan di drenta e karbon marká kontené den e [1-13C]traser di piruvato (p.e., via PDH òf ruta trans-arterial). Abou: E grafiko di violin ta mustra e porsentahe di karbon (M1) ku un solo marka kombertí den asido aspártiko, asido sítriko i asido máliko despues di a marka slicenan di serebellar agudo ku [1-13C]pyruvate (t-test parehá; ** P <0.01). (E) Análisis amplio di historia di tempu di e trayekto indiká. Konsiderá solamente proteinanan ku P<0.05 na 8 siman. Liña trahá: no tin balor di ahuste (análisis di variashon di dos kaminda; * P <0.05; *** P <0.001). Datonan ta wòrdu ekspresá komo promedio±SEM.
Den nos analisis, katabolismo di BCAA a bira un di e trayektonan klave di up-regulashon. E echo aki ta sugerí fuertemente ku e volúmen di ventilashon ku ta drenta e siklo di TCA por kambia den PN ku no tin OXPHOS. Esaki por representá un forma grandi di rewiring metabóliko neuronal, ku por tin un impakto direkto riba fisiologia neuronal i sobrebibensia durante e mantenshon di disfunshon severo di OXPHOS. Konsistente ku e hipótesis aki, nos a haña ku e enzima anti-aterosklerótiko prinsipal PCx ta up-regulá (Mfn2cKO/CTRL ta kambia aproksimadamente 1.5 biaha; Figura 3A), ku ta katalisá e kombershon di piruvato pa oxaloasetato (28), ku ta kere ku ta den tehido selebral E ekspreshon ta restringí na astrosis (29, 30). Konsistente ku e resultadonan di proteómika, mikroskopia konfokal a mustra ku ekspreshon di PCx tabata oumentá spesífikamente i signifikantemente den PNnan ku defisiensia di OXPHOS, miéntras ku reaktividat di PCx tabata prinsipalmente restringí na e sèlnan glial di Bergmann besindario di e kòntròl (Figura 3B). Pa tèst funshonalmente e upregulashon opservá di PCx, nos a trata slicenan di serebelo agudo ku [1-13C]traser di piruvato. Ora piruvato a wòrdu oksidá pa piruvato dehidrogenasa (PDH), su etiketa di isótopo a disparsé, Pero ta wòrdu inkorporá den e intermediarionan di siklo di TCA ora piruvato ta wòrdu metabolisá pa reakshonnan vaskular (Figura 3D). Den sosten di nos datonan di proteómika, nos a opservá un kantidat grandi di markadónan for di e traser aki den e asido aspártiko di e slicenan di Mfn2cKO, miéntras ku asido sítriko i asido máliko tambe tabatin un tendensia moderá, ounke no signifikante (Figura 3D).
Den e neuronnan di dopamina di ratonnan MitoPark ku disfunshon mitokondrial kousa pa neuronnan di dopamina ku ta destruí spesífikamente e gene di e faktor di transkripshon mitokondrial A (Tfam) (Figura S6B), ekspreshon di PCx tambe tabata signifikantemente up-regulá (31), indikando ku arteriosklerosis di asido di asetona E okashon di e malesa ta wòrdu regulá durante e disfunshon di e neuronan OXPHOS den e kurpa. Ta bon pa menshoná ku a haña ku enzimanan úniko (32-34) ku por wòrdu ekspresá den neuronnan ku por ta asosiá ku arteriosklerosis ta signifikantemente up-regulá den PNnan ku no tin OXPHOS, manera propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA ta kombertí propionyl-CoA-CoA mitoconyl i mitocondrial succical enzima 3 (ME3), kende su ròl prinsipal ta pa rekuperá piruvato for di malat (Figura 3, A i C) (33, 35). Ademas, nos a haña un oumento signifikante den e enzima Pdk3, ku ta fosforila i asina inaktivá PDH (36), miéntras ku no a detektá kambionan den e enzima Pdp1 ku ta aktivá PDH òf e kompleho di enzima PDH mes (Figura 3A). Konsistentemente, den Mern2cKO PNs, e fosforilashon di e subunidad α1 α (PDHE1α) di e komponente di pyruvate dehydrogenase E1 di e kompleho PDH den Ser293 (konosí pa inhibi e aktividat di enzima di PDH) a wòrdu mehorá ( Figura S6C) (Figura S6C). Piruvato no tin akseso vaskular.
Finalmente, nos a haña ku e super trayekto di biosintesis di serina i glisina, e siklo di folate (1C) mitokondrial relashoná i biosintesis di prolina (Figura 1G i Figura S5C) tur ta signifikantemente up-regulá, segun informenan, durante e proseso di aktivashon. E tehidonan rònt di dje ta wòrdu aktivá ku disfunshon mitokondrial (5-7). Análisis konfokal ku ta sostené e datonan proteómiko aki a mustra ku den PN ku OXPHOS faltando, slicenan serebelar di ratonnan di 8 siman bieu a wòrdu sometí na serina hidroksimetiltransferasa 2 (SHMT2), un enzima klave di e siklo di folate mitokondrial. Kontesta imunológiko signifikante (Figura S5D). Den 13 slice di serebellar agudo inkubá ku CU-glukosa, eksperimentonan di rastreo metabóliko a konfirmá mas aleu e up-regulashon di biosintesis di serina i prolina, indikando ku e fluho di isoformanan di karbon den serina i prolina a oumentá (Figura S5E). Komo ku e reakshonnan promové pa GLS i GPT2 ta responsabel pa e síntesis di glutamato for di glutamina i e transaminashon entre glutamato i α-ketoglutarato, nan upregulashon ta indiká ku neuronnan defisiente di OXPHOS tin un demanda oumentá pa glutamato , Esaki por ta dirigí na mantené e oumento di biosíntesis di proline (Figura S5). Na kontraste ku e kambionan aki, un analisis proteómiko di astrositonan serebelar di ratonnan Mfn2cKO spesífiko pa PN a mustra ku e trayektonan aki (inkluso tur antiperoxidase) no a kambia signifikantemente den ekspreshon, demostrando asina E redirekshon metabóliko aki ta selektivo pa PN degradá (Fig. S6, D pa G).
Den resumen, e analisisnan aki a revelá patronchinan signifikantemente diferente di aktivashon temporal di trayektonan metabóliko spesífiko den PN. Aunke funshon mitokondrial neuronal abnormal por kondusí na aterosklerosis trempan i remodelashon di 1C (Figura 3E i Figura S5C), i asta kambionan predecibel den e ekspreshon di komplehonan I i IV, e kambionan den síntesis di serina de novo ta solamente El a bira bisto solamente den e fasenan lat. Disfunshon di OXPHOS (Figura 3E i Figura S5C). E resultadonan aki ta definí un proseso sekuensial den kua e kontesta mitokondrial (siklo 1C) i sitoplasmátiko (biosíntesis di serina) indusí pa strès ta kontestá sinérgicamente ku e oumento den aterosklerosis den e siklo TCA pa remodela metabolismo neuronal.
PNnan di 8 siman bieu ku defisiensia di OXPHOS por mantené aktividat di eksitashon di frekuensha haltu i pasa den rekonekshon metabóliko signifikante pa kompensá pa disfunshon mitokondrial. E deskubrimentu aki ta lanta un posibilidat interesante ku asta na e momentu aki, e sèlnan aki tambe por Risibí intervenshon terapéutiko pa retrasá òf prevení neurodegenerashon. Lat. Nos a resolvé e posibilidat aki a traves di dos intervenshon independiente. Den e promé método, nos a diseñá un vektor di vírùs asosiá ku adeno (AAV) dependiente di Cre pa asina MFN2 por wòrdu ekspresá selektivamente den PNnan ku defisiensia di OXPHOS in vivo (Figura S7A). E AAV ku ta kódifika MFN2 i e gene reporter fluorescente mCherry (Mfn2-AAV) a wòrdu verifiká den kulturanan di neuron primario in vitro, loke a kousa ku MFN2 a wòrdu ekspresá na un manera dependiente di Cre i a reskatá e morfologia mitokondrial, preveniendo asina neuromutashon den neuronnan Mfn2cKO ( Figura S7, B i B). Siguientemente, nos a kondusí eksperimentonan in vivo pa entregá stereotaktikamente Mfn2-AAV di 8 siman na e korteks serebelar di Mfn2cKO i ratonnan di kòntròl, i a analisá ratonnan di 12 siman (Figura 4A). E ratonnan Mfn2cKO tratá a muri (Figura 1, A i B) (16). Transdukshon viral in vivo a resultá den ekspreshon selektivo di PN den algun sirkulo serebelar (Figura S7, G i H). E inyekshon di e AAV di kòntròl ku ta ekspresá solamente mCherry (Ctrl-AAV) no tabatin efekto signifikante riba e grado di neurodegenerashon den animalnan Mfn2cKO. Na kontraste, e analisis di Mfn2cKOs transdusí ku Mfn2-AAV a mustra un efekto protektivo signifikante di e kapa di cel PN (Figura 4, B i C). En partikular, e densidat di neuron ta parse di ta kasi indistinguibel for di e animalnan di kòntròl (Figura 4, B i C, i Figura S7, H i I). E ekspreshon di MFN1 pero no MFN2 ta igualmente efektivo den salba morto neuronal (Figura 4C i Figura S7, C i F), loke ta indiká ku e ekspreshon di MFN1 ektópiko por suplementá e falta di MFN2 efektivamente. Mas analisis na e nivel di PN úniko a mustra ku Mfn2-AAV a reskatá pa gran parti e ultrastruktura di mitokondria, a normalisá nivelnan di mtDNA, i a revertí e ekspreshon haltu di e markadó anti-angiogénesis PCx (Figura 4, C pa E ). Inspekshon visual di e ratonnan Mfn2cKO reskatá den un estado di sosiegu a mustra ku nan postura i síntomanan motoriko (moveshon S1 pa S3) a mehorá. Den konklushon, e eksperimentonan aki ta mustra ku reintrodukshon retrasá di MFN2 den PNnan severamente defisiente den OXPHOS ta sufisiente pa revertí konsumo di mtDNA i indusí aterosklerosis, preveniendo asina degenerashon di axon i morto neuronal in vivo.
(A) Un skema ku ta mustra e skema eksperimental pa inyektá AAV ku ta kodifiká MFN2 ora e trayekto metabóliko indiká ta wòrdu aktivá. (B) Potrètnan konfokal representativo di sekshonnan serebelar di 12 siman bieu transdusí ku ratonnan Mfn2cKO na 8 siman i marká ku antikurpa anti-Calbindin. Na man drechi: Eskalashon di fibranan di axon. E eskala di e zoom di axon ta 450 i 75 μm. (C) Robes: Kuantifikashon di densidat di sèl di Purkinje den e buèlta di transdukshon di AAV (AAV+) (análisis di variashon di un solo kaminda; n = 3 raton). Na man drechi: analisis di enfoke di mtDNA den PN transdusí na siman 12 (t-test sin pareha; n = 6 sèl di tres raton). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Mikrografianan di elektrón di transmishon representativo di PNs di sekshonnan serebelar di Mfn2cKO transdusí ku e vektornan viral indiká. E maskarada ros ta ilustrá e área okupá pa dendrita, i e kuadra hel ku punto ta ilustrá e zoom suministrá na man drechi; n ta representá e núkleo. Bara di eskala, 1μm. (E) ta mustra un ehèmpel di manchamentu di PCx den PN transdusí na 12 siman. Bara di eskala, 20μm. OE, sobreekspreshon; FC, kambio di dobla.
Finalmente, nos a investigá e importansia di sobrebibensia di cel indusí pa peroxidase den PNnan ku a eksperensiá disfunshon di OXPHOS. Nos a generá mCherry ku ta kódifika AAV-shRNA (RNA di hairpin kòrtiku) ku ta dirigí spesífikamente riba mRNA di PCx di raton (AAV-shPCx), i a inyektá e vírùs òf su kòntròl scrambled (AAV-scr) den e serebelum di ratonnan Mfn2cKO. E inyekshon a wòrdu realisá den e di kuater siman di edat (Figura 5A) pa logra un knockdown efektivo di PCx durante e periodo ku ekspreshon di PCx a oumentá (Figura 3C) i e kapa di sèl di PN tabata intakto ainda (Figura 1A). Ta bon pa menshoná ku destruí PCx (Figura S8A) ta kondusí na un aselerashon signifikante di morto di PN, ku ta e úniko renchi restringí di infekshon (Figura 5, B i C). Pa por komprondé e mekanismo di e efektonan metabóliko indusí pa PCx up-regulation, nos a studia e status di redox di PNs despues di knockdown di PCx i e biosensor optiko media pa AAV Grx1-roGFP2 a wòrdu ekspresá simultáneamente (Figura S8, B pa D) pa evaluá glutathione E kambio relativo di e potensial di peptido redox (383). Despues, nos a realisá mikroskopia di imágen di bida di fluorescencia di dos foton (FLIM) den slaisnan di selebro agudo di Mfn2cKO di 7 siman bieu òf kompañeronan di kòntròl pa detektá kambionan potensial den status di redox sitoplasmátiko despues di a verifiká kondishonnan di FLIM (Figura S8, E pa G). E analisis a mustra un oumento signifikante den e estado di oksidashon di un solo Mfn2cKO PNs ku no tin ekspreshon di PCx, ku ta diferente for di neuronnan di kòntròl òf Mfn2cKO PNs ku ta ekspresá solamente shRNA scrambled (Figura 5, D i E). Ora ekspreshon di PCx a wòrdu regulá abou, e porsentahe di Mfn2cKO PNs ku ta mustra un estado altamente oxidá a oumentá ku mas ku tres biaha (Figura 5E), indikando ku regulashon di PCx a mantené e kapasidat redox di neuronnan degenerá.
(A) Un skema ku ta mustra e skema eksperimental pa inyektá AAV ku ta kódifika shPCx ora e trayekto metabóliko indiká ta wòrdu aktivá. (B) Potrètnan konfokal representativo di sekshonnan serebelar di 8 siman bieu den ratonnan Mfn2cKO transdusí i marká ku antikurpa anti-kalsineurina na 4 siman. Bara di eskala, 450μm. (C) Kuantifikashon di densidat di sèl di Purkinje den buèltanan transdusí pa AAV (análisis di variashon di un solo kaminda; n = 3 pa 4 raton). Datonan ta wòrdu ekspresá komo promedio±SEM; ***P<0.001. (D) Potrèt representativo di FLIM ta mustra e durashon di bida promedio di PN di 7 siman bieu ku ta ekspresá e sensor redox di glutation Grx1-roGFP2 bou di e kondishonnan eksperimental spesifiká. LUT (look-up table) ratio: intervalo di tempu di sobrebibensia (den pikosekònde). Bara di eskala, 25μm. (E) E histogram ta mustra e distribushon di balornan di bida di Grx1-roGFP2 for di (D) (n=158 pa 368 sèl den dos raton bou di kada kondishon). E grafiko di pie riba kada histogram: ta mustra e kantidat di sèlnan ku balornan di bida signifikantemente mas largu (kòrá, oxidá) òf mas kòrtiku (blou, redusí), ku ta surpasá 1 SD di e balor promedio di bida den CTRL-AAV-scr. (F) E modelo proponé ta mustra e efekto protektivo di regulashon di PCx neuronal.
Na tur, e datonan ku nos ta proveé ​​aki ta mustra ku e re-ekspreshon di MFN2 por reskatá kompletamente PN avansá ku defisiensia severo di OXPHOS, agotamentu severo di mtDNA, i morfologia sumamente abnormal manera ista, proveyendo asina progreso kontinuo asta den malesanan avansá. Neurodegenerashon ta duna evidensia reversibel di e etapa promé ku morto di cel. E grado di fleksibilidat metabóliko aki ta wòrdu enfatisá mas aleu dor di e abilidat di neuronnan pa indusí aterosklerosis (un rewiring di e siklo di TCA), ku ta inhibi ekspreshon di PCx den PNnan ku no tin OXPHOS i ta mehorá morto di cel, hungando asina un ròl protektivo (Figura 5F).
Den e estudio aki, nos a proveé ​​evidensia ku e kontesta di PNs na disfunshon di OXPHOS ta pa konvergí gradualmente na aterosklerosis di siklo di TCA a traves di e trayekto di aktivashon diferensial aktivá pa programanan metabóliko. Nos a konfirmá e analisis proteómiko ku hopi método komplementario i a revelá ku ora nan ta wòrdu desafiá pa disfunshon mitokondrial severo, neuronnan tin un forma di elastisidat metabóliko deskonosí anteriormente. Pa nos sorpresa, henter e proseso di rewiring no nesesariamente ta marka e estado metabóliko terminal ku ta kompañá neurodegenerashon gradualmente i ireversibelmente, pero nos datonan ta sugerí ku e por konstituí un neuron di mantenshon asta den e etapa promé ku morto di cel Mekanismo di kompensashon funshonal. E resultado aki ta indiká ku neuronnan tin un grado konsiderabel di plastisidat metabóliko den e kurpa. E echo aki ta proba ku e reintrodukshon mas lat di MFN2 por revertí e ekspreshon di markadónan metabóliko klave i prevení degenerashon di PN. Al kontrario, e ta inhibi aterosklerosis i ta aselerá nervionan. transeksual.
Un di e resultadonan mas fasinante den nos investigashon ta ku PNnan ku no tin OXPHOS por modifiká e metabolismo di e siklo di TCA dor di up-regulashon di enzimanan ku ta stimulá arteriosklerosis spesífikamente. Rearreglo metabóliko ta un karakterístika komun di celnan di kanser, algun di nan ta dependé di glutamina pa suplementá intermediarionan di siklo di TCA pa produsí ekivalentenan reduktivo, ku ta impulsá e kadena respiratorio i ta mantené e produkshon di prekursornan di biosíntesis di lipid i nukleotido (39 , 40). Un estudio resien a mustra ku den tehidonan perifériko ku ta eksperensiá disfunshon di OXPHOS, e rekonekshon di metabolismo di glutamina/glutamato tambe ta un karakterístika prominente (5, 41), kaminda e direkshon di entrada di glutamina den e siklo di TCA ta dependé di Pa motibu di e severidat di leshon di OXPHOS (41). ). Sinembargo, tin falta di evidensia kla riba kualke similaridat di plastisidat metabóliko neuronal den e kurpa i su posibel relevansia den e konteksto di malesa. Den un estudio in vitro resien, a demostrá ku neuronnan kortikal primario ta mobilisá gruponan di glutamato pa neurotransmishon, promoviendo asina metabolismo oksidativo i aterosklerosis bou di kondishonnan di strès metabóliko (42). Ta bon pa menshoná ku bou di e inhibishon farmakológiko di e enzima di siklo di TCA suksinato dehidrogenasa, ta kere ku karboksilashon di piruvato ta mantené e síntesis di oxaloasetato den neuronnan di granula serebellar kultivá (34). Sinembargo, e relevansia fisiológiko di e mekanismonan aki pa e tehido di selebro (kaminda ta kere ku aterosklerosis ta prinsipalmente limitá na astrositonan) ainda tin nifikashon fisiológiko importante (43). Den e kaso aki, nos datonan ta mustra ku PNnan daña pa OXPHOS den e kurpa por wòrdu kambia pa degradashon di BCAA i karboksilashon di piruvato, ku ta e dos fuentenan prinsipal di suplementashon di intermediarionan di e pool di TCA. Aunke e kontribushon putativo di katabolismo di BCAA na metabolismo di energia neuronal a wòrdu proponé, ademas di e ròl di glutamato i GABA pa neurotransmishon (44), ainda no tin evidensia pa e mekanismonan aki in vivo. P’esei, ta fásil pa spekulá ku PNnan disfunshonal por kompensá outomatikamente pa e konsumo di intermediarionan di TCA impulsá pa e proseso di asimilashon dor di oumentá aterosklerosis. En partikular, upregulashon di PCx por ta nesesario pa mantené un demanda oumentá pa asido aspártiko, ku a wòrdu mustra den celnan proliferante ku disfunshon mitokondrial (45). Sinembargo, nos analisis metabolómiko no a revelá ningun kambio signifikante den e nivel di estado konstante di asido aspártiko den Mfn2cKO PNs (Figura S6A), ku probablemente ta reflehá e diferente utilisashon metabóliko di asido aspártiko entre celnan proliferante i neuronnan post-mitótiko. Aunke e mekanismo eksakto di upregulashon di PCx den neuronnan disfunshonal in vivo mester wòrdu karakterisá, nos a demostrá ku e kontesta prematuro aki ta hunga un ròl importante den mantenshon di e estado redox di neuronnan, loke a keda demostrá den eksperimentonan di FLIM riba slicenan serebelar. En partikular, prevení PNs di up-regula PCx por kondusí na un estado mas oxidá i aselerá morto di cel. E aktivashon di degradashon di BCAA i e karboksilashon di piruvato no ta maneranan pa karakterisá e tehidonan perifériko di disfunshon mitokondrial (7). P’esei, nan ta parse di ta un karakterístika di prioridat di neuronnan ku defisiensia di OXPHOS, asta si no ta e úniko karakterístika, ku ta importante pa neurodegenerashon. .
Malesa serebelar ta un tipo heterogéneo di malesa neurodegenerativo ku por lo general ta manifestá komo ataxia i hopi bia ta daña PN (46). E poblashon di neuron aki ta partikularmente vulnerabel pa disfunshon mitokondrial pasobra nan degenerashon selektivo den raton ta sufisiente pa reprodusí hopi di e síntomanan motoriko ku ta karakterisá ataxia spinocerebellar humano (16, 47, 48). Di akuerdo ku informenan, un modelo di raton transgéniko ku un gene mutante ta asosiá ku ataxia spinocerebellar humano i tin disfunshon mitokondrial (49, 50), enfatisando e importansia di studia e konsekuensianan di defisiensia di OXPHOS den PNPH. P'esei, e ta partikularmente adekuá pa isolá i studia e poblashon di neuron úniko aki di un manera efektivo. Sinembargo, mirando ku PN ta hopi sensitivo na preshon i ta responsabel pa un proporshon abou di henter e poblashon di sèl serebelar, pa hopi estudio basá riba omics, separashon selektivo di nan komo sèl kompletu ta un aspekto difísil ainda. Aunke ta kasi imposibel pa logra falta apsoluto di kontaminashon di otro tiponan di sèl (speshalmente tehidonan adulto), nos a kombiná un paso di disosiashon efektivo ku FACS pa optené un kantidat sufisiente di neuronnan viabel pa analisis di proteómika downstream, i tin un kobertura di proteina basta haltu (mas o ménos 3000 proteina) kompará ku e set di dato eksistente di henter e serebelo (15). Dor di konserbá e viabilidat di celnan kompletu, e método ku nos ta proveé ​​aki ta permití nos no solamente pa kontrolá e kambionan den e trayektonan metabóliko den e mitokondria, pero tambe pa kontrolá e kambionan den su kontrapartenan sitoplasmátiko, ku ta komplementá e uso di enrikesimentu di etiketa di membrana di mitokondria spesífiko pa tiponan di cel E método nobo pa e kantidat di kompleho di mitokondria den tehido (255, 25). E método ku nos ta deskribí no ta solamente relashoná ku e estudio di celnan di Purkinje, pero por wòrdu apliká fásilmente na kualke tipo di cel pa atendé kambionan metabóliko den selebronan malu, inkluyendo otro modelonan di disfunshon mitokondrial.
Finalmente, nos a identifiká un bentana terapéutiko durante e proseso di re-areglo metabóliko aki ku por revertí kompletamente e señalnan klave di strès selular i prevení degenerashon neuronal. P’esei, komprondementu di e implikashonnan funshonal di e rewiring deskribí aki por duna bista fundamental riba posibel tratamentunan pa mantené viabilidat neuronal durante disfunshon mitokondrial. Investigashon den futuro dirigí riba diseká kambionan den metabolismo di energia den otro tipo di celnan di selebro ta nesesario pa revelá kompletamente e aplikabilidat di e prinsipio aki na otro malesanan neurológiko.
Ratonnan MitoPark a wòrdu deskribí anteriormente (31). Ratonnan C57BL/6N ku loxP ku ta flankeá genenan Mfn2 a wòrdu deskribí anteriormente (18) i krusá ku ratonnan L7-Cre (23). E desendensia dòbel heterozigoto resultante despues a wòrdu krusá ku ratonnan homozigoto Mfn2loxP/Mfn2loxP pa generá knockoutnan di gene spesífiko di Purkinje pa Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Den un supkonhunto di parehamentu, e alelo Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) a wòrdu introdusí a traves di krusamentu adishonal (20). Tur e proseduranan di bestia a wòrdu realisá di akuerdo ku guianan Oropeo, nashonal i institushonal i aprobá pa LandesamtfürNatur di Umwelt i Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Alemania. Trabou riba bestia tambe ta sigui e guia di e Federashon Oropeo di Asosiashonnan di Siensia di Animal di Laboratorio.
Despues di anestesia e dislokashon di e garganta di e muhé na estado, e embrio di raton ta wòrdu isolá (E13). E korteks a wòrdu diseká den Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) suplementá ku 10 mM Hepes i a pasa riba Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium ku ta kontené papain (20 U/ml) i sisteina (1μg/ml). Inkubá e tehido den DMEM) i disosia esaki dor di digestion enzimátiko. Ml) na 37°C pa 20 minüt, i despues moli mekanikamente den DMEM suplementá ku 10% di serum bovino fetal. Sèlnan a wòrdu sembra riba tapa di glas kubri ku polilisina na un densidat di 2×106 pa kada plato di kultura di 6 cm òf na un densidat di 0.5×105 sèl/cm2 pa analisis di imágen. Despues di 4 ora, e medio a wòrdu remplasá ku medio liber di suero Neurobasal ku ta kontené 1% suplemento B27 i 0.5 mM GlutaMax. Despues a mantené e neuronnan na 37°C i 5% CO2 durante henter e eksperimento, i a wòrdu alimentá un biaha pa siman. Pa por indusí rekombinashon in vitro, 3μl (24-well dish) òf 0.5μl (24-well plate) di e siguiente vektor di vírùs AAV9 a wòrdu usá pa trata neuronnan riba e di dos dia in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, number di katalogo 105530-AAV9) i AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, number di katalogo 105545-AAV9).
DNA komplementario di raton Mfn1 i Mfn2 (obtené for di Addgene plasmid #23212 i #23213, respektivamente) ta marká ku e sekuensia V5 (GKPIPNPLLGLDST) na e C-terminus, i ta fusioná ku mCherry den kuadro a traves di e sekuensia T2A. Grx1-roGFP2 ta un regalo di Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Dor di remplasá e kasèt di tdTomato usando métodonan di klonashon konvenshonal, e kasèt a wòrdu subkloná den e wesu di lomba di pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (number di referensia di Addgene 28306) pa generá pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-G Vektornan FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 i pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Un strategia similar a wòrdu usá pa generá e vektor di kòntròl pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Pa por generá e konstrukto di AAV-shPCx, un vektor di AAV di plasmido (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) ta nesesario, ku ta kontené e sekuensia di DNA ku ta kodifiká e shRNA ku ta dirigí riba PCx di raton (5′CTTTCGCTAGCTAGGCTAAGGCTAAGGCTAGACTTAGA 3′) Bou di e kòntròl di e promotor U6, mCherry ta wòrdu usá bou di e kòntròl di e promotor di CMV. E produkshon di vektornan AAV ousiliar a wòrdu realisá segun e instrukshonnan di e fabrikante (Cell Biolabs). Den kòrtiku, usa un plasmido di transferensia ku ta karga mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) transitoriamente Transfekshon di sèl 29A-MFN2-V5-AV5-AV5, mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) òf Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) ku ta kódifika gene, i tambe ku ta kódifika proteina di kapsid AAV1 i proteina asesorio Plasmid di empaketahe, usando e método di fosfato di kalsio. E supernatante di e vírùs krudo a wòrdu optené dor di siklonan di vries-thaw den un baño di ijs/etanol seku i sèlnan lisá den salina buffer ku fosfato (PBS). E vektor AAV a wòrdu purifiká dor di ultrasentrifugashon di gradiente di iodixanol diskontinuo (24 ora na 32.000 rpm i 4°C) i konsentrá usando un filter sentrifugal ultra-15 Amicon. Títer di genoma di AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 kopia di genoma (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX tabata manera deskribí anteriormente (45), kuantitativo di PCR (PCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) i AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
Neuronan primario a wòrdu raspa den 1x PBS friu manera ijs, pellet, i despues homogeneisá den 0.5% Triton X-100 / 0.5% sodium deoxycholate/PBS lysis buffer ku ta kontené fosfatasa i inhibidor di proteasa (Roche). Kuantifikashon di proteina a wòrdu realisá dor di usa e ensayo di asido bicinchoninico (Thermo Fisher Scientific). E proteinanan despues a wòrdu separá pa medio di elektroforesis di gel di SDS-poliakrilamida, i despues a wòrdu blot riba un membrana di polivinilideno fluoride (GE Healthcare). Blòkia sitionan no-spesifiko i inkubá ku e antikurpa primario (wak Tabel S1 pa detaye) den 5% di lechi den TBST (salina Tris-buffered ku Tween), pasonan di labamentu i antikurpa sekundario den TBST Inkubá. Inkubá ku antikurpa primario durante anochi na +4°C. Despues di laba, apliká e antikurpa sekundario pa 2 ora na temperatura di kamber. Siguientemente, dor di inkubá e mesun blot ku un antikurpa anti-β-aktina, e mesun kargamentu a keda konfirmá. Detekshon dor di kombertí na kimiluminisensia i mehorá kimioluminisensia (GE Healthcare).
E neuronan ku a wòrdu sembra anteriormente riba tapa di glas a wòrdu fihá ku 4% paraformaldehído (PFA)/PBS na e punto di tempu spesifiká na temperatura di kamber pa 10 minüt. E coverslips ta wòrdu permeá promé ku 0.1% Triton X-100/PBS pa 5 minüt na temperatura di kamber, i despues den buffer di blokeo [3% bovine serum albumin (BSA)/PBS]. Riba e di dos dia, e coverslipnan a wòrdu labá ku tampón di blokeo i inkubá ku e antikurpa sekundario konhugá ku fluoroforo apropiá pa 2 ora na temperatura di kamber; finalmente, e muestranan a wòrdu labá kompletamente den PBS ku 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) ta wòrdu kontrasteñá i despues fihá riba e slide di mikroskop ku Aqua-Poly/Mount.
Ratonnan (maskulino i muhé) a wòrdu anestesiá dor di inyekshon intraperitoneal di ketamina (130 mg/kg) i xylazine (10 mg/kg) i a wòrdu atministrá subkutáneamente ku analgésiko di karprofen (5 mg/kg), i a wòrdu poné den un instrumento stereotáktiko (Kopf) ekipá ku un warm. Eksponé e kranio i usa un drill dental pa hasi e parti di e korteks serebelar ku ta korespondé na e wesu mis (for di lambda: rabo 1.8, lateral 1, korespondiente na lóbulonan IV i V). Usa un aguja di jeringa kurvá pa krea kuidadosamente un buraku chikitu den e kranio pa evitá di stroba e vaskulatura abou. Despues e kapilar di glas fini ta wòrdu insertá pokopoko den e mikro-buraku (di -1.3 pa -1 na e banda ventral di e dura mater), i 200 pa 300 nl AAV ta wòrdu inyektá den e mikro-inyektor (Narishige) ku spuitnan manual (Narishige) vários biaha na preshon abou durante un periodo di tempu di bentana pa 20 minüt. Despues di e infushon, pone e kapilar pa 10 minüt mas pa permití e vírùs plama kompletamente. Despues ku e kapilarnan ta wòrdu retirá, e kueru ta wòrdu sutura kuidadosamente pa minimalisá inflamashon di herida i permití e animal rekuperá. E bestianan a wòrdu tratá ku analgésiko (caspofen) pa vários dia despues di e operashon, durante kua tempu nan kondishon físiko a wòrdu monitoriá kuidadosamente i despues nan a wòrdu eutanasia na e punto di tempu indiká. Tur e proseduranan a wòrdu realisá di akuerdo ku e guianan Oropeo, nashonal i institushonal i a wòrdu aprobá pa LandesamtfürNatur di Umwelt i Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Alemania.
E bestianan a wòrdu anestesiá ku ketamina (100 mg/kg) i xylazine (10 mg/kg), i e kurason a wòrdu perfundí ku 0.1 M PBS promé, i despues ku 4% PFA den PBS. E tehido a wòrdu diseká i fihá den 4% PFA/PBS durante anochi na 4°C. Un kuchú vibrante (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) a wòrdu usá pa prepará sekshonnan sagital (50 μm diki) for di e selebro fiho den PBS. A ménos ku ta spesifiká otro, a hasi manchamentu di sekshonnan ku ta bula liber manera deskribí ariba (13) na temperatura di kamber i agitashon. Den kòrtiku, promé, e slicenan optené a wòrdu permeabilisá ku 0.5% Triton X-100/PBS pa 15 minüt na temperatura di kamber; pa algun epitope (Pcx i Shmt2), dor di den un buffer di tris-EDTA na 80°C (PH 9) keinta e slicenan pa 25 minüt en bes di e paso aki. Siguientemente, e sekshonnan a wòrdu inkubá ku antikurpa primario (wak Tabel S1) den buffer di blokeo (3% BSA/PBS) na 4°C durante anochi ku agitashon. E siguiente dia, e sekshonnan a wòrdu laba ku tampón di blokeo i inkubá ku e antikurpa sekundario konhugá ku fluoroforo apropiá pa 2 ora na temperatura di kamber; finalmente, e sekshonnan a wòrdu labá kompletamente den PBS, kontra-mancha ku DAPI, i despues fihá ku AquaPolymount Riba un slide di mikroskop.
Un mikroskop konfokal di skan di laser (TCS SP8-X òf TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) ekipá ku un laser di lus blanku i un laser ultravioleta di 405 diodo a wòrdu usá pa imágen e muestra. Dor di eksitá e fluoroforo i rekohé e señal ku Hybrid Detector (HyDs), software LAS-X a wòrdu usá pa rekohé imágennan staka ku ta konforme ku Nyquist sampling den modo sekuensial: pa panelnan no-kuantitativo, ta señalnan altamente dinámiko (por ehèmpel, den celnan somátiko i dendritnan) mtYFP pa sede Hybrid Detector den e kantidat drechi di BPNR moda). Gating di 0.3 pa 6 ns ta wòrdu apliká pa redusí fondo.
Imágennan den tempu real di celnan ordená. Despues di a klasifiká den medio Neurobasal-A ku ta kontené 1% di suplemento B27 i 0.5 mM GlutaMax, e sèlnan a wòrdu sembra mesora riba slides di glas ku ta kubri ku poli-l-lisina (μ-Slide8 Well, Ibidi, number di katalogo 80826) , i despues a tene esaki na 37°C i CO pa un ora pa e sèl regla. Imágennan den tempu real a wòrdu realisá riba un mikroskop konfokal di skan di laser Leica SP8 ekipá ku un laser blanku, HyD, lens di ophetivo di zeta di 63×[1.4 apertura numeriko (NA)] i un etapa di keintamentu.
E raton a wòrdu anestesiá lihé ku dióksido di karbon i dekapitá, e selebro a wòrdu kita lihé for di e kranio, i kòrtá den un sekshon sagital di 200μm diki (pa eksperimento di markamentu di 13C) òf 275μm diki (pa dos eksperimento di foton) yená ku e siguiente materialnan E ijskrèm (HM-605, Vher, Scientific Walldorf, Alemania) ta yená ku e siguiente supstansianan: 125 mM ijs-friu, saturá ku karbon (95% O2 i 5% CO2) abou di Ca2 + líkido serebrospinal artifisial (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampón di fosfato di sodio, NaCl 2.5 mM, mM CO2 0.5 mM CaCl2 i 3.5 mM MgCl2 (preshon osmótiko di 310 pa 330 mmol). Transferí e slicenan di selebro optené pa un kamber di pre-inkubashon ku ta kontené Ca2 + ACSF mas haltu (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM buffer di fosfato di sodio, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 10 mM i Ca.20 mM. MgCl2) Medio) pH 7.4 i 310 pa 320 mmol).
Durante e proseso di imágen, e slicenan a wòrdu move den un sala di imágen dediká, i e eksperimento a wòrdu realisá bou di perfushon kontinuo di ACSF na un temperatura konstante di 32° pa 33°C. Un mikroskop di skan di laser multifoton (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) ekipá ku un lens di ophetivo Leica 25x (NA 0.95, awa), laser Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) a wòrdu usá pa imágen di slice. Módulo FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM di Grx1-roGFP2. E kambionan den e estado redox sitoplasmátiko di PN a wòrdu midi dor di FLIM di dos foton den slicenan di selebro sagital, kaminda e biosensor Grx1-roGFP2 a dirigí riba PN. Den e kapa di PN, e kampo di atkisishon ta wòrdu selektá mas o ménos 50 pa 80 μm bou di e superfisie di slice pa garantisá ku tin un PN viabel (esta, e falta di struktura di kralchi òf kambionan morfológiko neuronal kantu di e dendritanan) i e sensor di roGFP2 dòbel positivo i AAV ku ta kódifika shRNA PCx òf su sekuensia di kòntròl (kada ekspreshon di mChery). Kolektá imágennan di un solo stapel ku 2x zoom digital [longitud di ola di eksitashon: 890 nm; 512 nm 512 piksel]. Detekshon: HyD interno, grupo di filter di fluorescein isothiocyanate (FITC)] i averahe di imágen denter di 2 pa 3 minüt ta wòrdu usá pa garantisá ku sufisiente foton ta wòrdu rekohé (1000 foton en total) pa ajustamentu di kurva. E sensitividat di e sonda Grx1-roGFP2 i e verifikashon di e kondishonnan di FLIM a wòrdu realisá dor di monitoriá e balor di durashon di bida di roGFP2 ora a agregá 10 mM H2O2 eksógeno na e ACSF di perfushon (pa maksimisá oksidashon, resultando den un oumento di durashon di bida), i despues agregá 2 mM dithiothreit (resultando den e grado di redukshon di iol, bahada den durashon di bida) (Figura S8, D pa G). Usa e software FLIMfit 5.1.1 pa analisá e resultadonan atkerí, ​​fit e kurva di dekadensia eksponensial úniko di henter e imágen na e IRF (funshon di kontesta di instrumento) midi, i χ2 ta aproksimadamente 1. Pa kalkulá e durashon di bida di un solo PN, e maskarada rònt di e kurpa di nervio a wòrdu traha manualmente, i a usa un kuantifikashon di durashon di bida pa kada maskarada.
Análisis di potensial mitokondrial. Despues ku e sekshon agudo a wòrdu inkubá ku 100 nM TMRM direktamente agregá na e ACSF perfusá pa 30 minüt, e kambionan di potensial mitokondrial di PNs a wòrdu midi pa un mikroskop di dos foton. Imágen di TMRM a wòrdu realisá dor di eksitá e sonda na 920 nm i usando HyD interno (tetrametilrodamina isotiosianato: 585/40 nm) pa rekohé señalnan; dor di usa e mesun largura di ola di eksitashon pero usando un HyD interno diferente (FITC :525/50) pa imágen mtYFP. Usa e plug-in di ImageJ su Image Calculator pa evaluá e potensial mitokondrial na nivel di un solo sèl. Den kòrtiku, e ekuashon di plug-in: señal = min (mtYFP, TMRM) ta wòrdu usá pa identifiká e region mitokondria ku ta mustra e señal TMRM den Purkinje Somali den e imágen konfokal di un solo pila di e kanal korespondiente. Despues e área di piksel den e maskarada resultante ta wòrdu kalkulá, i despues normalisá riba e imágen di un solo stapel di drempel korespondiente di e kanal di mtYFP pa optené e frakshon mitokondria ku ta mustra e potensial mitokondria.
E imágen a wòrdu dekonvolushoná ku e software Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Pa e potrètnan skan di tegelnan, e montahe di un solo tegel ta wòrdu hasí usando e algoritmo di kosementu outomátiko suministrá pa e software LAS-X. Despues di kalibrashon di imágen, usa ImageJ i Adobe Photoshop pa sigui prosesá e imágen i ahusta e briyo i kontraste uniformemente. Usa Adobe Illustrator pa preparashon di grafiko.
Análisis di enfoke di mtDNA. E kantidat di leshonnan di mtDNA a wòrdu kalkulá riba sekshonnan serebelar marká ku antikurpanan kontra DNA pa medio di mikroskop konfokal. Kada área di meta a wòrdu kreá pa e kurpa di e sèl i e núkleo di kada sèl, i e área respektivo a wòrdu kalkulá usando e plug-in Multi Measure (software ImageJ). Resta e área nuklear for di e área di kurpa di cel pa optené e área sitoplasmátiko. Finalmente, e plug-in di Analyze Particles (software ImageJ) a wòrdu usá pa kalkulá outomatikamente e puntonan di DNA sitoplasmátiko ku ta indiká mtDNA riba e imágen di drempel, i e resultadonan optené a wòrdu normalisá na e promedio di PN di ratonnan CTRL. E resultadonan ta wòrdu ekspresá komo e kantidat promedio di nukleosido pa sèl.
Análisis di ekspreshon di proteina. Usa e plug-in di ImageJ su Image Calculator pa evaluá ekspreshon di proteina den PN na nivel di un solo sèl. Den kòrtiku, den e imágen konfokal di un solo kapa di e kanal korespondiente, a traves di e ekuashon: señal = min (mtYFP, antikurpa), e region mitokondrial ku ta mustra imunoreaktividat na un sierto antikurpa den Purkina ta wòrdu identifiká. Despues e área di piksel den e maskarada resultante ta wòrdu kalkulá, i despues normalisá riba e imágen di un solo stapel di drempel korespondiente di e kanal di mtYFP pa optené e frakshon mitokondrial di e proteina mustra.
Análisis di densidat di sèl di Purkinje. E plug-in di Cell Counter di ImageJ a wòrdu usá pa evaluá e densidat di Purkinje dor di dividí e kantidat di celnan di Purkinje kontá pa e largura di e renchi serebelar okupá pa e celnan kontá.
Preparashon i rekohementu di muestra. E selebronan di e grupo di kòntròl i ratonnan Mfn2cKO a wòrdu fihá den 2% PFA/2.5% glutaraldehído den 0.1 M buffer di fosfato (PB), i despues a prepará sekshonnan koronal usando ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (Diki 50 pa 60) E buffer fiho den 1% PB tetraóksido i 1.5% di ferosianuro di potasio na temperatura di kamber pa 1 ora. E sekshonnan a wòrdu labá tres biaha ku awa destilá, i despues a wòrdu mancha ku 70% di etanol ku ta kontené 1% di uranil asetat pa 20 minüt. E sekshonnan despues a wòrdu deshidratá den alkohòl gradiá i inkorporá den Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences, number di katalogo 14040) entre slides di glas ku ta kubri ku silikon, i finalmente na 60°C Polimerisá den fornu pa 48 ora. E área di korteks serebelar a wòrdu selektá i sekshonnan ultrafino di 50 nm a wòrdu kòrtá riba Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) i a wòrdu piki riba un grid di slit di koper di 2×1 mm revesti ku pelíkula di polistireno. E sekshonnan a wòrdu mancha ku un solushon di 4% uranil asetato den H2O pa 10 minüt, labá ku H2O vários biaha, despues ku sitrato di plomo di Reynolds den H2O pa 10 minüt, i despues labá ku H2O vários biaha. Mikrografianan a wòrdu tumá ku un mikroskopio elektróniko di transmishon Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Merka) usando un kámara digital TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, Merka). Alemania).
Pa ratonnan infektá ku AAV, e selebro a wòrdu separá i kòrtá den un sekshon sagital di 1 mm diki, i e serebelo a wòrdu analisá usando un mikroskop di fluorescencia pa identifiká e renchi infektá ku AAV (esta, mCherry ku ta ekspresá). Solamente eksperimentonan den kua inyekshon di AAV ta resultá den un efisiensia di transdukshon hopi haltu di e kapa di cel di Purkinje (es desir kasi henter e kapa) den por lo ménos dos renchi serebellar konsekutivo ta wòrdu usá. E buèlta transdusí pa AAV a wòrdu mikrodiseká pa post-fiksashon durante anochi (4% PFA i 2.5% glutaraldehído den 0.1 M buffer di koko) i prosesá mas aleu. Pa embeyesementu di EPON, e tehido fiho a wòrdu labá ku 0.1 M di tampón di kakao di sodio (Applichem), i inkubá ku 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) den 0.1 M di tampón di kakao di sodio (Applichem) 4 Ora, despues laba pa 2 ora. Ripití 3 biaha ku 0.1 M di buffer di kokamida. Siguientemente, e seri asendente di etanol a wòrdu usá pa inkubá kada solushon di etanol na 4°C pa 15 minüt pa deshidratá e tehido. E tehido a wòrdu transferí pa òksido di propileno i inkubá durante anochi den EPON (Sigma-Aldrich) na 4°C. Pone e paña den EPON fresku na temperatura di kamber pa 2 ora, i despues hink’é na 62°C pa 72 ora. Usa un ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) i un kuchú di diamante (Diatome, Biel, Suisa) pa kòrta sekshonnan ultrafino di 70 nm, i mancha ku 1.5% uranil asetat pa 15 minüt na 37°C, i mancha ku solushon di sitrato di plomo 4 minüt. E mikrografnan di elektrón a wòrdu tumá usando un mikroskop di elektrón di transmishon JEM-2100 Plus (JEOL) ekipá ku Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) i software di DigitalMicrograph (Gatan). Pa analisis, mikrografonan di elektrón a wòrdu atkerí ku 5000× òf 10.000× zoom digital.
Análisis morfológiko di mitokondria. Pa tur e analisisnan, e konturnan di mitokondria individual a wòrdu delineá manualmente den imágennan digital usando software ImageJ. Diferente parameter morfológiko ta wòrdu analisá. Densidat di mitokondria ta wòrdu ekspresá komo un porsentahe optené dor di dividí e área total di mitokondria di kada sèl pa e área di sitoplasma (área di sitoplasma = área di sèl-área di núkleo di sèl) × 100. E rondo di mitokondria ta wòrdu kalkulá ku e fórmula [4π∙(area/perimeter 2)]. E morfologia di ista di mitokondria a wòrdu analisá i dividí den dos kategoria (“tubular” i “blister”) segun nan formanan prinsipal.
Análisis di kantidat i densidat di outofagosoma/lisosoma. Usa e software ImageJ pa delineá manualmente e konturnan di kada outofagosoma/lisosoma den e imágen digital. Área di outofagosoma/lisosoma ta wòrdu ekspresá komo un porsentahe kalkulá dor di dividí e área total di struktura di outofagosoma/lisosoma di kada sèl pa e área di sitoplasma (área di sitoplasma=área di sèl-área di núkleo)×100. E densidat di outofagosoma/lisosoma ta wòrdu kalkulá dor di dividí e kantidat total pa e kantidat di strukturanan di outofagosoma/lisosoma pa sèl (pa loke ta trata área sitoplasmátiko) (área sitoplasmátiko = área di sèl-área nuklear).
Etikèt pa sekshon agudo i preparashon di muestra. Pa eksperimentonan ku ta rekerí etiketashon di glukosa, transferí e slicenan di selebro agudo pa un kamber di pre-inkubashon, ku ta kontené karbon saturá (95% O2 i 5% CO2), Ca2 + ACSF haltu (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM buffer di fosfato di sodio, 2.5 mM NaCl. d-glukosa, 1.0 mM CaCl 2 i 2.0 mM MgCl 2, ahusta na pH 7.4 i 310 pa 320 mOsm), den kua glukosa ta 13 C 6- Sustitushon di glukosa (Eurisotop, number di katalogo CLM-1396). Pa eksperimentonan ku ta rekerí markamentu di piruvato, transferí e slicenan di selebro agudo pa un Ca2 + ACSF mas haltu (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampón di fosfato di sodio, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukosa, 10 mM Ca.Cl y 20 MM. MgCl2, ahusta na pH 7.4 i 310 pa 320mOsm), i agregá 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, number di katalogo CLM-1082). Inkubá e sekshonnan pa 90 minüt na 37°C. Na final di e eksperimento, e sekshonnan a wòrdu labá lihé ku un solushon akuoso (pH 7.4) ku ta kontené 75 mM di karbonato di amonio, i despues a wòrdu homogenisá den 40:40:20 (v:v:v) asetonitrilo (ACN): metanol: awa. Despues ku e sekshonnan a wòrdu inkubá riba ijs pa 30 minüt, e muestranan a wòrdu sentrifugá na 21.000 g pa 10 minüt na 4°C, i e supernatante kla a wòrdu seku den un konsentradó di SpeedVac. E pèlèt di metabolito seku resultante a wòrdu wardá na -80°C te ora di analisá.
Análisis di kromatografia líkido-spektrometria di masa di 13 amino asido marká ku C. Pa analisis di kromatografia líkido-spektrometria di masa (LC-MS), e pèlèt di metabolito a wòrdu resuspendé den 75μl di awa di grado LC-MS (Honeywell). Despues di sentrifugashon na 21.000 g pa 5 minüt na 4°C, 20 μl di e supernatante klarifiká a wòrdu usá pa analisis di fluho di amino asido, miéntras ku e restu di e ekstrakto a wòrdu usá mesora pa analisis di anion (wak mas abou). Análisis di aminoácido a wòrdu realisá usando e protokòl di derivatisashon di klorido di benzoil deskribí anteriormente (55, 56). Den e promé paso, 10μl di 100 mM karbonato di sodio (Sigma-Aldrich) a wòrdu agregá na 20μl di ekstrakto di metabolito, i despues 10μl di 2% benzoyl chloride (Sigma-Aldrich) a wòrdu agregá na e ACN di grado LC. E muestra a wòrdu vortex brevemente i despues sentrifugá na 21.000 g pa 5 minüt na 20°C. Transferí e supernatante limpia pa un vial di 2 ml di outosampler ku un inserto di glas kóniko (200 μl di volúmen). E muestranan a wòrdu analisá usando e sistema di LC di ultra-haltu rendimentu di Acquity iClass (Waters) konektá na e spektrometer di masa di presishon di haltu resolushon Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Pa analisis, 2μl di e muestra derivá a wòrdu inyektá den un kolumna T3 di sílika di 100×1.0 mm di resistensia haltu (Waters) ku ta kontené partikulonan di 1.8μm. E fluho ta 100μl/min, i e sistema di buffer ta konsistí di buffer A (10 mM formato di amonio i 0.15% di asido fórmiko den awa) i buffer B (ACN). E gradiente ta lo siguiente: 0%B na 0 minüt; 0%B. 0 pa 15% B na 0 pa 0.1 minüt; 15 pa 17% B na 0.1 pa 0.5 minüt; B na 17 pa 55% na 0.5 pa 14 minüt; B na 55 pa 70% na 14 pa 14.5 minüt; na 14.5 pa 70 pa 100% B na 18 minüt; 100% B na 18 pa 19 minüt; 100 pa 0% B na 19 pa 19.1 minüt; 0% B na 19.1 pa 28 minüt (55, 56). E spektrómetro di masa QE-HF ta operá den moda di ionisashon positivo ku un rango di masa di m/z (relashon di masa/karga) di 50 pa 750. E resolushon apliká ta 60.000, i e meta di ion di kontrol di ganashi (AGC) optené ta 3×106, i e tempu máksimo di ion ta 100 milisekònde. E fuente di ionisashon di elektrospray kayente (ESI) ta operá na un voltahe di spuit di 3.5 kV, un temperatura kapilar di 250°C, un fluho di airu di 60 AU (unidatnan arbitrario), i un fluho di airu ousiliar di 20 AU. 250°C. E lens S ta set na 60 AU.
Análisis di kromatografia di anion-MS di ácidonan orgániko marká ku 13C. E presipitashon di metabolito ku a sobra (55μl) a wòrdu analisá usando un sistema di kromatografia di ion Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) konektá na un spektrometer di masa QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Den kòrtiku, 5μl di ekstrakto di metabolito a wòrdu inyektá den un kolumna di Dionex IonPac AS11-HC ekipá ku HPLC (2 mm×250 mm, tamaño di partikulo 4μm, Thermo Fisher Scientific) den modo di buèlta parsial push-in ku un relashon di yenamentu di 1. )on. Dionex IonPac AG11-HC guard column (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). E temperatura di e kolumna ta wòrdu mantené na 30°C, i e autosampler ta wòrdu poné na 6°C. Usa un kartucho di hidróxido di potasio suministrá ku awa deionisá pa generá un gradiente di hidróxido di potasio a traves di e generador di eluente. Separashon di metabolitonan na un fluho di 380μl/min, aplikando e siguiente gradiente: 0 pa 3 minüt, 10 mM KOH; 3 pa 12 minüt, 10 pa 50 mM KOH; 12 pa 19 minüt, 50 pa 100 mM KOH; 19 pa 21 minüt, 100 mM KOH; 21 pa 21.5 minüt, 100 pa 10 mM KOH. E kolumna a wòrdu re-ekilibrá bou di 10 mM KOH pa 8.5 minüt.
E metabolitonan eluí ta wòrdu kombiná ku un fluho di suplemento di isopropanol di 150μl/min despues di e kolumna i despues ta wòrdu dirigí na un spektrómetro di masa di resolushon haltu ku ta operá den modo di ionisashon negativo. MS ta monitoriá e rango di masa di m/z 50 pa 750 ku un resolushon di 60.000. E AGC ta wòrdu fihá na 1×106, i e tempu máksimo di ion ta wòrdu mantené na 100 ms. E fuente di ESI keintá tabata operá na un voltahe di spuit di 3.5 kV. E otro settingnan di e fuente di ion ta lo siguiente: temperatura kapilar 275°C; fluho di gas di vaina, 60 AU; fluho di gas ousiliar, 20 AU na 300°C, i setting di lens S na 60 AU.
Análisis di dato di metabolitonan marká ku 13C. Usa e software di TraceFinder (vershon 4.2, Thermo Fisher Scientific) pa analisis di dato di e proporshon di isótopo. E identidat di kada komponente a wòrdu verifiká dor di un komponente di referensia konfiabel i analisá independientemente. Pa por hasi analisis di enrikesimentu di isótopo, e área di e kromatograma di ion ekstraí (XIC) di kada isótopo 13C (Mn) a wòrdu ekstraí for di [M + H] +, kaminda n ta e kantidat di karbon di e komponente meta, usá pa analisá aminoácidonan òf [ MH] + ta wòrdu usá pa analisá anionnan. E eksaktitut di masa di XIC ta ménos ku sinku parti pa mion, i e eksaktitut di RT ta 0.05 minüt. E analisis di enrikesimentu ta wòrdu realisá dor di kalkulá e relashon di kada isótopo detektá na e suma di tur isótopo di e komponente korespondiente. E proporshonnan aki ta wòrdu duná komo balornan di porsentahe pa kada isótopo, i e resultadonan ta wòrdu ekspresá komo enrikesimentu di porsentahe molar (MPE), manera deskribí anteriormente (42).
E pèlèt di neuron kongelá a wòrdu homogeneisá den metanol 80% friu manera ijs (v/v), vorteks, i inkubá na -20°C pa 30 minüt. Vortex e muestra atrobe i stèr na +4°C pa 30 minüt. E muestra a wòrdu sentrifugá na 21.000 g pa 5 minüt na 4°C, i despues e supernatante resultante a wòrdu rekohé i seku usando un konsentradó di SpeedVac na 25°C pa siguiente analisis. Manera deskribí ariba, a realisá analisis di LC-MS riba e amino asidonan di e celnan ordená. Usando TraceFinder (vershon 4.2, Thermo Fisher Scientific), a realisá analisis di dato usando e masa monoisotópiko di kada komponente. Normalisashon kuantil di datonan di metabolito a wòrdu realisá usando e pakete di software preprocessCore (57).
Preparashon di slice. E raton a wòrdu anestesiá lihé ku dióksido di karbon i dekapitá, e selebro a wòrdu kita lihé for di e kranio, i e kuchú vibrante yená ku ijs (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemania) a wòrdu usá pa kòrt’é den sekshonnan sagital di 300 pa 375 μm gasifikashon di karbon i COD friu (29% 25) Ca2 + ACSF abou (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampón di fosfato di sodio, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukosa, 1.0 mM CaCl2 i 6.0 mM MgCl2 Ahustá na pH na 40 mM i 33 mO). Transferí e slicenan di selebro optené pa un kamber ku ta kontené Ca2 + ACSF mas haltu (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 4.0 ml CaCl mM i pH 2 MM 7.4 i 310 pa 320 mOsm). Warda e slicenan pa 20 pa 30 minüt pa nan por wòrdu restourá promé ku graba.
grabashon. Un etapa di mikroskop ekipá ku un kamber di grabashon fiho i un lens di ophetivo di inmershon den awa 20x (Scientifica) a wòrdu usá pa tur grabashon. E celnan putativo di Purkinje a wòrdu identifiká pa (i) tamaño di kurpa, (ii) lokalidat anatómiko di e serebelo, i (iii) ekspreshon di e gene reporter mtYFP fluoresente. E pipeta di pleister ku un resistensia di punta di 5 pa 11 megohms ta wòrdu saka dor di un kapilar di glas di borosilikat (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Alemania) i un pipeta horizontal Instruments (P-10000), Sutter, CA). Tur grabashon a wòrdu realisá dor di ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, Alemania), ku tabata wòrdu kontrolá dor di e software Signal (vershon 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). E eksperimento a wòrdu registrá na un velosidat di muestra di 12.5 kHz. E señal ta wòrdu filtrá ku dos filter di Bessel di pasa kòrtiku ku frekuensianan di kòrtamentu di 1.3 i 10 kHz respektivamente. E kapasidat di e membrana i e pipeta ta wòrdu kompensá dor di e sirkuito di kompensashon usando e amplifikadó. Tur eksperimento a wòrdu realisá bou di e kòntròl di un kámara Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Alemania), ku tabata wòrdu kontrolá pa e software Hokawo (vershon 2.8, Hamamatsu, Gerden, Alemania).
Konfigurashon i analisis di rutina di henter e sèl. Inmediatamente promé ku graba, yena e pipeta ku e solushon interno ku ta kontené e siguiente supstansianan: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM glukonato di potasio, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (MM), 5 MM trifosifato. (GTP) (Na) i 10.0 mM fosfato di kreatinina a wòrdu ahusta na pH 7.25, i e preshon osmótiko tabata 290 mOsm (sukrosa). Inmediatamente despues di apliká un forsa di 0 pA pa kibra e membrana, a midi e potensial di e membrana di sosiegu. E resistensia di entrada ta wòrdu midi dor di apliká korientenan hiperpolarisá di -40, -30, -20, i -10 pA. Midi e magnitut di e kontesta di voltahe i usa e lei di Ohm pa kalkulá e resistensia di entrada. Aktividat spontáneo a wòrdu registrá den un klem di voltahe pa 5 minüt, i sPSC a wòrdu identifiká i midi den Igor Pro (vershon 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, Merka) usando un skript di rekonosementu semi-outomátiko. E kurva IV i e koriente di estado konstante ta wòrdu midi dor di klem e bateria na diferente potensial (kuminsando for di -110 mV) i oumentá e voltahe den pasonan di 5 mV. E produkshon di AP a wòrdu tèst dor di apliká un koriente depolarisante. Klem e sèl na -70 mV miéntras ta apliká un pulso di koriente depolarisante. Ahustá e tamaño di paso di kada unidat di grabashon separadamente (10 pa 60 pA). Kalkulá e frekuensha máksimo di AP dor di konta manualmente e spikenan di pulso ku ta kousa e frekuensha di AP mas haltu. E drempel di AP ta wòrdu analisá dor di usa e di dos derivado di e pulso di depolarisashon ku ta trigger promé un òf mas AP.
Konfigurashon i analisis di pleister perforá. Hasi grabashon di pleister perforá usando protokòlnan standart. Usa un pipeta liber di ATP i GTP ku no ta kontené e siguiente ingredientenan: 128 mM glukonato K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA i 2 mM MgCl2, i ahusta na pH 7.2 (usando KOH). ATP i GTP ta wòrdu omití for di e solushon intraselular pa prevení permeabilidat deskontrolá di e membrana di cel. E pipeta di pleister ta wòrdu yená ku un solushon interno ku ta kontené anfoterisina (mas o ménos 200 pa 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) pa optené un registro di e pleister perforá. Amfoterisina a wòrdu disolvé den dimetil sulfóksido (konsentrashon final: 0.1 pa 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). E konsentrashon di DMSO usá no tabatin efekto signifikante riba e neuronan studia. Durante e proseso di ponche, e resistensia di kanal (Ra) a wòrdu monitoriá kontinuamente, i e eksperimento a wòrdu kuminsá despues ku e amplitut di Ra i AP a stabilisá (20-40 minüt). Aktividat spontáneo ta wòrdu midi den un klem di voltahe i/òf koriente pa 2 pa 5 minüt. Análisis di dato a wòrdu realisá usando Igor Pro (vershon 7.05.2, WaveMetrics, Merka), Excel (vershon 2010, Microsoft Corporation, Redmond, Merka) i GraphPad Prism (vershon 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Merka). Pa por identifiká APnan spontáneo, e plug-in NeuroMatic v3.0c di IgorPro ta wòrdu usá. Identifiká APnan outomatikamente usando un drempel duná, ku ta wòrdu ahusta individualmente pa kada registro. Usando e intervalo di spike, determiná e frekuensha di spike ku e frekuensha di spike instantáneo máksimo i e frekuensha di spike promedio.
Isolashon di PN. Dor di adaptá na e protokòl publiká anteriormente, PNs a wòrdu purifiká for di e serebelo di raton na un fase spesifiká (58). Den kòrtiku, e serebelo a wòrdu diseká i kòrtá den medio di disosiashon friu manera ijs [sin HBSS Ca2+ i Mg2+, suplementá ku 20 mM glukosa, penisilina (50 U/ml) i streptomisina (0.05 mg/ ml)], i despues a digeri e medio den papa [HBSS suplementá ku steina, (1 mg / ml), papain (16 U / ml) i deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] Trata pa 30 minüt na 30°C. Promé laba e tehidonan den medio HBSS ku ta kontené slijm di webu (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) i DNase (0.1 mg/ml) na temperatura di kamber pa prevení digestion enzimátiko, i despues den e medio HBSS ku ta kontené 20 mM glukosa Moli suavemente den HBSS peillin, streplin/ml/ml (0.05 mg/ml) i DNase (0.1 mg/ml) ta liberá sèlnan individual. E suspenshon di cel resultante a wòrdu filtrá a traves di un filtro di cel di 70μm, despues e celnan a wòrdu pelletá pa medio di sentrifugashon (1110 rpm, 5 minüt, 4°C) i resuspendé den medio di sorteo [HBSS, suplementá ku 20 mM glukosa, 20% fetal bovino ) Serum, peliníniko (50/5)/strep (0.05 mg/ml)]; evaluá viabilidat di cel ku yoduro di propidio i ahusta e densidat di cel na 1×106 pa 2×106 cel/ml. Promé ku sitometria di fluho, e suspenshon a wòrdu filtrá a traves di un filtro di cel di 50 μm.
Sitometro di fluho. Sorteo di cel a wòrdu realisá na 4°C usando mashin FACSAria III (BD Biosciences) i software FACSDiva (BD Biosciences, vershon 8.0.1). E suspenshon di cel a wòrdu ordená usando un botter di 100 μm bou di un preshon di 20 psi na un velosidat di ~2800 evento/sek. Komo ku kriterionan di gating tradishonal (tamaño di cel, diskriminashon bimodal, i karakterístika di dispershon) no por garantisá e isolashon korekto di PN for di otro tiponan di cel, e strategia di gating ta wòrdu fihá a base di e komparashon direkto di e intensidat di YFP i outofluorescencia den mitoYFP+ ​​i e mitoYFP − Ratonnan di kòntròl. YFP ta wòrdu eksitá dor di irradiá e muestra ku un liña di laser di 488 nm, i e señal ta wòrdu detektá usando un filter di pasa banda di 530/30 nm. Den ratonnan mitoYFP+, e forsa relativo di e gene reporter Rosa26-mitoYFP tambe ta wòrdu usá pa distinguí fragmentonan di kurpa neuronal i akson. 7-AAD ta wòrdu eksitá ku un laser hel di 561 nm i ta wòrdu detektá ku un filter di 675/20 nm pa ekskluí celnan morto. Pa por a separá astrositonan na mes momentu, e suspenshon di cel a wòrdu mancha ku ACSA-2-APC, despues e muestra a wòrdu irradiá ku un liña di laser di 640 nm, i un filter di bandpass di 660/20 nm a wòrdu usá pa detektá e señal.
E sèlnan rekohé a wòrdu pelletá pa medio di sentrifugashon (1110 rpm, 5 minüt, 4°C) i warda na -80°C te ora di uso. Ratonnan Mfn2cKO i nan yunan di yu ta wòrdu klasifiká riba e mesun dia pa minimalisá variabilidat di prosedura. Presentashon i analisis di dato di FACS a wòrdu realisá usando software FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, Merka).
Manera menshoná ariba (59), PCR den tempu real ta wòrdu usá pa isolá DNA for di e neuronnan ordená pa kuantifikashon di mtDNA siguiente. E linearidat i e sensitividat di drempel a wòrdu tèst inisialmente dor di kore qPCR riba diferente kantidat di cel. Den kòrtiku, rekohé 300 PN den un buffer di lisis ku ta konsistí di 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 i proteinase K (200 ng/ml) i inkubá na 55°C 120 minüt. E sèlnan a wòrdu inkubá mas aleu na 95°C pa 10 minüt pa garantisá inaktivashon kompleto di proteinase K. Usando un sonda TaqMan (Thermo Fisher) spesífiko pa mt-Nd1, mtDNA a wòrdu midi pa medio di PCR semi-kuantitativo den e sistema di 7900HT Real-Time PCR (Thermoherific Scientifics). Siensia, number di katalogo Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, number di katalogo AIVI3E8) i 18S (Thermo Fisher Scientific, number di katalogo Hs99999901_s1) genes.
Preparashon di muestra di proteoma. Dor di keinta e solushon na 95°C pa 10 minüt i soniká, den e tampón di lisis [6 M di klorido di guanidina, 10 mM di klorido di tris(2-karboksietil) fosfina, 10 mM di kloroasetamida i 100 mM di tris-Lise frozen neuron pellets den HC]. Riba Bioruptor (Diagenode) pa 10 minüt (30 sekònde di pulso / 30 sekònde di periodo di pausa). E muestra a wòrdu diluí 1:10 den 20 mM tris-HCl (pH 8.0), mesklá ku 300 ng di oro di trypsin (Promega), i inkubá durante anochi na 37°C pa logra digestion kompleto. Riba e di dos dia, e muestra a wòrdu sentrifugá na 20.000 g pa 20 minüt. E supernatante a wòrdu diluí ku 0.1% di asido fórmiko, i e solushon a wòrdu desaliná ku StageTips trahá pa nan mes. E muestra a wòrdu seku den un instrumento SpeedVac (konsentrador di Eppendorf mas 5305) na 45°C, i despues e peptide a wòrdu suspendé den 0.1% di asido fórmiko. Tur muestra a wòrdu prepará simultáneamente dor di e mesun persona. Pa por analisá muestranan di astrosito, 4 μg di peptide desalu a wòrdu marká ku un tag di masa di tandem (TMT10plex, number di katalogo 90110, Thermo Fisher Scientific) ku un relashon di reaktivo di peptide pa TMT di 1:20. Pa markashon di TMT, 0.8 mg di reaktivo TMT a wòrdu resuspendé den 70 μl di ACN anhidro, i e peptide seku a wòrdu rekonstituí den 9 μl di 0.1 M TEAB (bikarbonato di trietilamonio), na kua 7 μl di reaktivo TMT den ACN a wòrdu agregá. E konsentrashon tabata 43.75%. Despues di 60 minüt di inkubashon, e reakshon a wòrdu apagá ku 2 μl di 5% hidroksilamina. E peptidenan etiketá a wòrdu rekohé, seku, resuspendé den 200μl di 0.1% di asido fórmiko (FA), dividí den dos, i despues desalu usando StageTips trahá pa nan mes. Usando UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph), un di e dos mitarnan a wòrdu frakshoná riba un kolumna kromatográfiko Acquity di 1mm x 150mm yená ku partikulonan di 130Å1.7μm C18 (Waters, katalogo No SKU: 1966). Thermo Fisher Scientific). Separá e peptidenan na un fluho di 30μl/min, separá di 1% pa 50% di buffer B pa 85 minüt ku un gradiente paso a paso di 96 minüt, di 50% pa 95% di buffer B pa 3 minüt, despues 8 minüt pa 95 % di buffer B; Buffer A ta 5% ACN i 10 mM bikarbonato di amonio (ABC), i buffer B ta 80% ACN i 10 mM ABC. Kolektá frakshonnan kada 3 minüt i kombiná nan den dos grupo (1 + 17, 2 + 18, etc.) i seku nan den un sentrifuga di vakuo.
Análisis di LC-MS/MS. Pa spektrometria di masa, e peptidenan (number r119.aq) a wòrdu separá riba un kolumna analítiko PicoFrit di 25 cm, 75 μm di diameter interno (lens di ophetivo nobo, number di parti PF7508250) ekipá ku 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ medium (Maischr, Maisch, UAS. 1200 (Thermo Fisher Scientific, Alemania). E kolumna a wòrdu mantené na 50°C. Buffer A i B ta 0.1% asido fórmiko den awa i 0.1% asido fórmiko den 80% ACN, respektivamente. Peptidenan a wòrdu separá ku un gradiente paso a paso di 200 nl/min di 6% pa 31% di buffer B pa 65 minüt, i di 31% pa 50% di buffer B pa 5 minüt. E peptidenan eluí a wòrdu analisá riba un spektrometer di masa di Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Midimentu di m/z di prekursor di peptido ta wòrdu realisá ku un resolushon di 120.000 den e rango di 350 pa 1500 m/z. Usando 27% di energia di kolishon normalisá, e prekursor mas fuerte ku un estado di karga di 2 pa 6 ta wòrdu selektá pa disosiashon di trampa C di energia haltu (HCD). E tempu di siklo ta wòrdu fihá na 1 s. E balor m/z di e fragmento di peptide a wòrdu midi den e trampa di ion usando e meta di AGC mas chikitu di 5×104 i e tempu di inyekshon máksimo di 86 ms. Despues di fragmentashon, e prekursor a wòrdu poné riba e lista di eksklushon dinámiko pa 45 s. Peptidonan marká ku TMT a wòrdu separá riba un kolumna di 50 cm, 75 μm di Acclaim PepMap (Thermo Fisher Scientific, number di katalogo 164942), i e spektronan di migrashon a wòrdu analisá riba un spektrometer di masa Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) ekipá ku ionnan di ola simétriko di kampo haltu (IMS) ekipo (Thermo Fisher Scientific) ta operá na dos voltahe di kompensashon di −50 i −70 V. MS3 selektá a base di e prekursor di sinkronisashon ta wòrdu usá pa midimentu di señal di ion di rapòrt TMT. E separashon di peptide a wòrdu realisá riba EASY-nLC 1200, usando un elushon di gradiente lineal di 90%, ku un konsentrashon di buffer di 6% pa 31%; tampón A tabata 0.1% FA, i tampón B tabata 0.1% FA i 80% ACN. E kolumna analítiko ta wòrdu operá na 50°C. Usa FreeStyle (vershon 1.6, Thermo Fisher Scientific) pa parti e archivo original segun e voltahe di kompensashon di FAIMS.
Identifikashon i kuantifikashon di proteina. Usando e motor di búskeda integral di Andromeda, e datonan original a wòrdu analisá usando MaxQuant vershon 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Ademas di e sekuensianan di Cre recombinase i YFP optené for di Aequorea victoria, a buska spektronan di fragmento di peptide pa e sekuensia kanóniko i sekuensia di isoforma di e proteoma di referensia di raton (Proteome ID UP000000589, download for di UniProt na mei 2017) . Oksidashon di metionina i asetilashon N-terminal di proteina a wòrdu fihá komo modifikashonnan variabel; metilashon di karbamoil di sisteina a wòrdu fihá komo modifikashonnan fiho. E parameternan di digestion ta wòrdu fihá na “spesifisidat” i “trypsin/P”. E kantidat mínimo di peptide i peptide di razor ku ta wòrdu usá pa identifikashon di proteina ta 1; e kantidat mínimo di peptide úniko ta 0. Bou di e kondishonnan di matching di mapa di peptide, e tasa di identifikashon di proteina tabata 0.01. E opshon “Di Dos Péptido” ta aktivá. Usa e opshon “match between runs” pa transferí identifikashonnan eksitoso entre diferente archivo original. Usa e kantidat di rasio mínimo di LFQ 1 pa kuantifikashon sin etiketa (LFQ) (60). E intensidat di LFQ ta wòrdu filtrá pa por lo ménos dos balor bálido den por lo ménos un grupo di genotipo na kada punto di tempu, i ta wòrdu ekstrapolá for di un distribushon normal ku un largura di. 0.3 i baha 1.8. Usa e plataforma di komputadó Perseus (https://maxquant.net/perseus/) i R (https://r-project.org/) pa analisá e resultadonan di LFQ. Un t-test moderá di dos kaminda for di e pakete di software limma a wòrdu usá pa analisis di ekspreshon diferensial (61). Análisis di datonan eksploratorio ta wòrdu realisá usando ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally i pheatmap. E datonan di proteómika basá riba TMT a wòrdu analisá usando MaxQuant vershon 1.6.10.43. Buska datonan di proteómika brutu for di e base di dato di proteómika humano di UniProt, ku a wòrdu download na sèptèmber 2018. E analisis ta inkluí e faktor di korekshon di puresa di isótopo suministrá pa e fabrikante. Usa limma den R pa analisis di ekspreshon diferensial. E datonan original, resultadonan di búskeda di base di dato, i fluho di trabou i resultadonan di analisis di dato tur ta wòrdu wardá den e aliansa ProteomeXchange a traves di e repositorio di partner PRIDE ku e identifikadó di set di dato PXD019690.
Anotashonnan funshonal ta enrikesé e analisis. E herment di Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) a wòrdu usá pa determiná e rikesa di e términonan di anotashon funshonal di e set di dato na 8 siman (Figura 1). Den kòrtiku, e lista di proteina kuantioso optené for di analisis di dato di LC-MS/MS (spektrometria di masa tandem) ta wòrdu usá ku e siguiente kriterionan di filtro: Mus musculus ta wòrdu selektá komo e espesie i fondo, i e kategoria ta mustra ku e balor di P ahusta pa Benjamini pa enrikesimentu 0.05 òf mas abou ta wòrdu konsiderá signifikante. Pa e grafiko aki, e sinku kategorianan di ekseso mas haltu den kada klúster basá riba e balor P ahusta ta wòrdu mustra. Usando múltiple t-test, usando e programa di impulso lineal di dos etapa di Benjamini, Krieger, i Yekutieli (Q = 5%), analisis di ekspreshon di proteina di kurso di tempu ta wòrdu realisá riba e kandidatonan importante identifiká den kada kategoria, i kada liña ta wòrdu analisá separadamente. No tin mester di adoptá un SD konsistente.
Pa por kompará e resultadonan di e estudio aki ku basenan di dato publiká i generá un diagram di Venn den Figura 1, nos a kombiná e lista di proteina kuantitativo ku anotashonnan di MitoCarta 2.0 (24). Usa e hèrmènt online Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) pa generá e diagram.
Pa informashon detayá riba e proseduranan estadístiko usá pa analisis di proteómika, por fabor referí na e sekshon korespondiente di Material i Método. Pa tur otro eksperimento, informashon detayá por wòrdu hañá den e leyenda korespondiente. A ménos ku ta spesifiká otro, tur dato ta wòrdu ekspresá komo promedio ± SEM, i tur analisis estadístiko a wòrdu realisá usando software GraphPad Prism 8.1.2.
Pa materialnan suplementario pa e artíkulo aki, por fabor wak http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Esaki ta un artíkulo di akseso habrí distribuí bou di e términonan di e Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, ku ta pèrmití e uso, distribushon i reprodukshon den kualke medio, basta ku e uso final no ta pa ganashi komersial i e premisa ta ku e obra original ta korekto. Referensia.
Nota: Nos ta pidi bo solamente pa duna bo adrès di email pa asina e persona ku bo ta rekomendá na e página sa ku bo ke pa nan mira e email i ku e no ta spam. Nos lo no kapturá ningun adrès di email.
E pregunta aki ta wòrdu usá pa tèst si bo ta un bishitante i prevení entrega di spam outomátiko.
Pa E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Análisis proteómiko di neuronnan disfunshonal a revelá ku programanan metabóliko ta wòrdu aktivá pa kontrarestá neurodegenerashon.
Pa E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Análisis proteómiko di neuronnan disfunshonal a revelá ku programanan metabóliko ta wòrdu aktivá pa kontrarestá neurodegenerashon.
©2020 Asosiashon Merikano pa e Avanse di Siensia. tur derecho reservá. AAAS ta partner di HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef y COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.