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E kompleho di kosecha di lus di sentro di reakshon 1 (RC-LH1) ta e komponente fotosintétiko núkleo di bakteria fototrófiko lila. Nos a introdusí dos struktura di mikroskopia di krio-elektron di e kompleho RC-LH1 for di Rhodopseudomonas palustris. E struktura di resolushon di 2.65-Å di e kompleho RC-LH114-W ta konsistí di 14 buèlta di subunidat LH1 rondoná RC, ku ta wòrdu interumpí pa proteina W, miéntras ku e kompleho sin proteina-W ta kompletamente komposishon RC rondoná pa RC. A sera e buèlta di 16 subunidat LH1. E komparashon di e strukturanan aki ta duna bista riba e dinámika di kinona den e kompleho RC-LH1, inkluyendo kambionan konformashonal indeterminá anteriormente ora di mara quinona na e sitio di RC QB, i tambe e lokalidat di sitionan di unimentu di quinona ousiliar, ku ta yuda Pasa nan pa RC. E struktura úniko di e proteina W ta prevení e seramentu di e buèlta LH1, kreando asina un kanal pa aselerá e interkambio di quinone/quinolone.
E energia ku fotosíntesis ta proveé ​​por sostené kasi tur bida riba tera, i e tin un potensial grandi pa bioteknologia solar. Miéntras ta promové fotosíntesis global, bakteria fototrófiko lila tambe ta eksponé vários manera di energia i kapasidatnan metabóliko. Nan por evitá fotosíntesis i krese komo bakteria heterotrófiko den skuridat, por fiha nitrógeno i dióksido di karbon, produsí hidrógeno, i degradá komponentenan aromátiko (1-3). Pa por proveé ​​energia pa e prosesonan aki, lus mester wòrdu kombertí lihé i efisientemente den energia kímiko. E proseso aki ta kuminsá ora e kompleho di antena ku ta atrapa lus ta apsorbé lus i ta transferí e energia atrapá pa e sentro di reakshon (RC), i asina ta kuminsá separashon di karga (4 – 7). E unidat básiko di fotosíntesis den bakteria fototrófiko lila ta komponé di tipo 2 RC, rondoná pa kompleho di kosecha di lus 1 (LH1), formando e kompleho di núkleo RC-LH1. LH1 ta wòrdu formá pa un array di heterodímero αβ kurvá, kada un di nan ta mara dos molèkül di klorofila bakterial (BChl) a i un òf dos karotenoide (8-12). E antena LH1 mas simpel ta konsistí di 16 òf 17 heterodímero αβ ku ta rondoná RC (9-13) den un buèlta será, pero den otro komplehonan di núkleo, peptidenan transmembrana ta interumpí e kontinuidat di e LH1 rònt di dje, promoviendo asina e difushon di kinol/kinona entre RC i e kompleho di sitokrom bc (1111, 13). E mata fototrófiko lila Rhodopseudomonas (Rps.) ta un organismo modelo ku por komprondé e transferensia di energia i elektrón ku ta sostené fotosíntesis. E promé struktura di kristal di Rps. E modelo di e kompleho di palustris RC-LH1 ta RC, rondoná pa 15 buèlta heterodimériko LH1, ku ta wòrdu interumpí pa un proteina deskonosí yamá “Proteina W” (14). Protein-W a wòrdu identifiká despues komo RPA4402, ku ta un proteina di 10.5kDa no karakterisá ku tres héliks transmembrana pronostiká (TMH) (16). Nos ta proponé pa kambia e nòmber di e gene rpa4402 ku ta kódifika proteina W pa pufW pa ta konsistente ku e nomenklatura usá pa genenan ku ta kódifika subunidatnan RC-L, M (pufL, pufM) i LH1α, β (pufA, pufB). Interesantemente, proteina-W ta presente solamente den mas o ménos 10% di RC-LH1, revelando Rps. palustris ta produsí dos diferente kompleho RC-LH1. Aki, nos ta informá e strukturanan di cryo-EM (cryo-EM) di resolushon haltu di dos kompleho di núkleo, un ku proteina W i 14 heterodimer αβ, e otro sin proteina W i un buèlta será di 16 Heterodimer LH1. Nos struktura ta representá un kambio di paso den e komprenshon di e kompleho RC-LH1 di Rps. palustris, pasobra nos a analisá e poblashon homogéneo di kada variante i tin sufisiente resolushon pa asigná klaramente kada peptide i pigmentonan mará i lipidonan i kinonan relashoná. E komparashon di e strukturanan aki ta mustra ku e tres proteinanan TMH-W ku no a wòrdu hañá den ningun otro kompleho RC-LH1 te awor ta generá un kanal di kinona pa aselerá e interkambio di kinona/kinona. Un kantidat di sitionan di unimentu di lipid i kinon konservá a wòrdu identifiká, i nos a revelá un kambio konformashonal nobo despues di e kombinashon di kinon i RC, ku por ta adekuá pa fotosistema II (PSII) RC di organismonan fototrófiko oksigená. Nos resultadonan ta duna bista nobo riba e kinétika di e unimentu i interkambio di quinone/quinolone den e kompleho di núkleo RC-LH1 di bakteria fototrófiko lila.
Pa por fasilitá un estudio detayá di e dos komplehonan hañá den Rps. palustris, nos ta isolá kada RC-LH1 pa medio di métodonan biokímiko. E kompleho defisiente di proteina W (aki despues referí na dje komo ΔpufW) a wòrdu purifiká for di e strain ku no tin e gene pufW (16), i solamente un kompleho RC-LH1 por wòrdu produsí. E kompleho di proteina W ku ta kontené ta wòrdu produsí dor di un strain. E proteina W di e strain aki ta wòrdu modifiká ku un 10x His tag na su C-terminal, di manera ku e kompleho ku ta kontené proteina W por wòrdu kombiná efektivamente ku mayoria di proteina W ku ta falta dor di inmobilisá metal. E kompleho ta separá efektivamente (16) Kromatografia di Afinidat (IMAC).
Manera ta mustra den Figura 1, tur dos kompleho ta kontené un RC di tres sub-unidat (RC-L, RC-M i RC-H) rondoná pa un antena LH1. E struktura 2.80-A di e kompleho ku no tin proteina-W ta mustra 16 heterodímero αβ, formando un buèlta LH1 será ku ta rondoná kompletamente RC, aki despues referí na dje komo e kompleho RC-LH116. E struktura di 2.65Å di e kompleho ku ta kontené proteina-W tin un 14-heterodímero LH1 interumpí pa proteina-W, aki despues referí na dje komo RC-LH114-W.
(A i B) Representashon di superfisie di e komponente. (C i D) Pigmentonan pegá ekspresá den bara. (E i F) E komplehonan opservá for di e superfisie sitoplasmátiko tin e peptidenan i subunidatnan LH1 representá den karikatura, i ta numerá den direkshon di oloshi for di e espasio di proteina-W [konsistente ku numerashon di Rba. sphaeroides complex (13)]. Pa LH1-α, e koló di e subunidad di proteina ta hel; pa LH1-β, e koló di e subunidad di proteina ta blou; pa proteina-W, e proteina ta kòrá; pa RC-H, e ta cyan; pa RC-L, e ta Oraño; pa RC-M, magenta. Kofaktornan ta wòrdu representá pa bara, bèrdè ta representá molèkülnan BChl i BPh a, lila ta representá karotenoidnan, i hel ta representá molèkülnan UQ10. (G i H) Bista engrandesé di e brecha di proteina-W den e region ekivalente di e kompleho RC-LH114-W (G) i e kompleho RC-LH116 (H). Kofaktornan ta wòrdu mustra den forma di yenamentu di espasio, kinona kelá ta wòrdu mustra den blou. E brecha di proteina-W ta wòrdu resaltá pa un liña blou trahá den (G), i e buraku chikitu kaminda quinone/quinolol ta difundí riba e renchi LH116 ta resaltá pa un liña pretu trahá den (H).
Figura 1 (A i B) ta mustra e RC rondoná pa arraynan habrí òf será di heterodímeronan LH1αβ, di kua kada un ta mara dos BChl i un karotenoide (Figura 1, C i D). Estudionan anterior a mustra ku Rps ta e kompleho LH1. Den e trayekto biosintetiko di spirulina xanthin, e espesienan aki ta kontené poblashonnan mesklá di karotenoide (17). Sinembargo, spiropyrroxanthin ta e karotenoide dominante i su densidat ta satisfaktorio. P’esei, nos a skohe pa modelá spiroxanthin na tur e sitionan di unimentu di LH1. E polipeptidonan alfa i beta ta TMHnan individual ku regionnan eksterno di membrana kòrtiku (Figura 1, A, B, E, i F). Aunke e densidat di 17 residuo na e C-terminal no a wòrdu opservá, e polipeptido alfa a wòrdu kòrtá for di Met1 pa Ala46 den tur dos kompleho. β polipeptido a wòrdu redusí di Gly4 pa Tyr52 den RC-LH116, i di Ser5 pa Tyr52 den RC-LH114-W. No a opservá densidat di 3 òf 4 residuo N-terminal òf 13 C-terminal (Figura S1). Análisis di spektrometria di masa di e kompleho miksto RC-LH1 prepará for di e strain di tipo salbahe a mustra ku e region ku falta tabata e resultado di scheur heterólogo di e peptidenan aki (Figura S1 i S2). E formilashon N-terminal di α-Met1 tambe a wòrdu opservá (f). E analisis a mustra ku e α-peptide ta konsistí di residuonan fMet1 pa Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, i e β-peptide ta konsistí di residuonan Ser2 pa Ala53, ku ta di akuerdo ku e mapa di densidat di EM di temperatura abou.
Kordinashon di α-His29 i β-His36 ta hasi BChls kara kara; kada heterodímero αβ ta reuní ku su bisiñanan pa forma un buèlta habrí (RC-LH114-W) òf un buèlta será (RC-LH116) rònt di e RC E array di pigmento akoplá ku eksiton (Figura 1, C i D). Kompará ku e banda di 877 nm di RC-LH114-W, e kambio kòrá di absorshon di 880 nm di RC-LH116 ta 3 nm (Figura 2A). Sinembargo, e spektrum di dikroismo sirkular ta kasi meskos (Figura 2B), indikando ku ounke tin un diferensia kla entre buèltanan habrí i será, e ambiente lokal di BChls ta hopi similar. E kambio kòrá di absorshon por ta e resultado di moveshon termal redusí i stabilidat oumentá riba e buèlta será (18, 19), e kambio den e koupling di pigmento kousa pa e buèlta será (20, 21), òf un kombinashon di e dos efektonan aki (11).
(A) Spektro di absorshon ultravioleta/visibel/serka-infrakòrá, di kua e piknan ta marká ku nan pigmentonan korespondiente i normalisá na e pik di BPh na 775 nm. (B) Spektrum di dikroismo sirkular normalisá pa absorbensia di BChl na 805 nm. (C i D) Spektronan ΔA selektá for di e spektronan di absorshon resolvé den tempu di e kompleho RC-LH114-W (C) i e kompleho RC-LH116 (D). Pa mihó komparabilidat, tur spektro ta wòrdu normalisá na ∆A di −A na 0.2 ps. (E) E tasa di oksidashon di sitokrom c2 despues di irradiashon den presensia di vários konsentrashon di UQ2 (wak Figura S8 pa datonan brutu). (F) Den celnan ku a krese bou di lus di intensidat abou, mediano òf haltu (10, 30 òf 300μMm-2 s-1, respektivamente), e subunidadnan di proteina W i RC-L den e kompleho purifiká i e relashon di membrana separá. Determiná e nivel di proteina dor di elektroforesis di gel di SDS-poliakrilamida i immunoassay (wak Figura S9 pa dato brutu). Determiná e proporshon relashoná ku e kompleho RC-LH114-W purifiká. E relashon stoikiométriko di RC-L pa proteina-W di e kompleho ta 1:1.
E BChls na posishon 1 den e buèlta αβ14 deformá di RC-LH114-W (Figura 1, A, C, i E) ta mas serka di e donante primario di RC (P) ku 6.8Å ku e BChls ekivalente den RC-LH116 (Figura. 1, B, D, i F, i S3); sinembargo, e kinétika di absorshon transitorio di e dos komplehonan ta mustra ku pa RC-LH114-W i RC-LH116, e konstantenan di tempu di transferensia di energia di eksitashon di LH1 pa RC ta 40 ±4 i 44±3 ps (Figura 2). , C i D, Figura S4 i Tabel S2). No tin tambe diferensia signifikante den transferensia elektróniko denter di RC (Figura S5 i teksto suplementario relashoná). Nos ta sospechá ku e korespondensia estrecho di e tempu di transferensia di energia entre LH1 i RC-P ta debí na e distansia, ángulo i energia potensial similar di mayoria di BChl den e dos buèltanan di LH1. Ta parse ku eksplorá e patronchi di energia LH1 pa alkansá e distansia mínimo no ta mas lihé ku transferensia di energia direkto for di sitionan suboptimal pa RC. E buèlta LH1 di buèlta habrí den RC-LH114-W tambe por pasa den moveshon termal insignifikante bou di kondishonnan di temperatura abou pa analisis struktural, i tin un konformashon di ring αβ14 mas largu na temperatura di kamber for di e distansia di pigmentashon di βBChls na e posishon di RC 1.
E kompleho RC-LH116 ta kontené 32 BChls i 16 karotenoide, i su areglo general ta meskos ku esun optené for di Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) DB strain (PDB07) (IDC 1997) i alga bèrdè (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Despues di alineashon, solamente desviashonnan chikitu den e posishonnan di heterodímeronan αβ a wòrdu opservá, spesialmente 1-5, 15, i 16 (Figura S6). E presensia di proteina-W tin un impakto signifikante riba e struktura di LH1. Su tres TMHnan ta konektá pa medio di buèlta kòrtiku, ku e N-terminal na e banda di lumen di e kompleho i e C-terminal na e banda sitoplasmátiko (Figuranan 1A i 3, A pa D). Protein-W ta pa gran parti hidrofóbiko (Figura 3B), i TMH2 i TMH3 ta interkambiá ku LH1αβ-14 pa forma un superfisie transmembrana (Figura 3, B i E pa G). E interfase ta prinsipalmente komponé di residuonan di Phe, Leu i Val den e region di transmembrana. E residuonan aki ta wòrdu staka ku aminoácidonan hidrofóbiko i pigmentonan αβ-14. Algun residuo polar tambe ta kontribuí na e interakshon, inkluyendo e enlase di hidrogeno entre W-Thr68 i β-Trp42 riba e superfisie di e kavidat kompleho (Figura 3, F i G). Riba e superfisie di e sitoplasma, Gln34 ta banda di e grupo keto di karotenoidnan αβ-14. Ademas, e molèkül di n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) a keda resolvé, i su rabo hidrofóbiko a ekstendé te na e interfase entre proteina-W i αβ-14, i e rabo di lípido por ta situá den e kurpa. Nos a nota tambe ku e regionnan di resolushon C-terminal di proteina W i RCH ta hopi serka, pero no den e alkanse di forma interakshonnan spesífiko (Figura 1, A i E). Sinembargo, por tin interakshonnan den e amino asidonan C-terminal no resolvé di e dos proteinanan aki, ku por proveé ​​un mekanismo pa e rekrutamentu di proteina-W durante e ensamblahe di e kompleho RC-LH114-W.
(A) Protein-W, ku ta enfrentá e interfase ku LH1αβ14 den forma di karikatura, tin un kadena lateral den forma di bara (kòrá), mustra den un parti di e diagram di potensial elektrostátiko (superfisie gris transparente ku un nivel di kontur di 0.13). (B) Proteina-W representá pa un superfisie di koló hidrofóbiko. Areanan polar i kargá ta wòrdu mustra den sian, áreanan hidrofóbiko ta wòrdu mustra den blanku, i áreanan fuertemente hidrofóbiko ta wòrdu mustra den oraño. (C i D) Protein-W representá den karikatura, su orientashon ta meskos ku den (A) (C), i rotá pa 180° (D). Di akuerdo ku e posishon den e sekuensia, e residuonan distinguibel ta adoptá un skema di koló di regenboog, kaminda e N-terminal ta blou i e C-terminal ta kòrá. (E) Proteina-W den e mesun bista ku den (A), i e residuonan na e interfase di proteina-W:LH1 ta wòrdu representá pa baranan ku markanan pegá. (F) Protein-W ta wòrdu rotá 90° relashoná ku (E) i LH1αβ14 den e representashon di karikatura, i relashoná ku e residuonan di interfase den e representashon di bar. E residuonan ku ta kologá for di e polipeptido beta ta marká. E kofaktor ta wòrdu mustra komo un bara ku ta kuadra ku e koló di Figura 1, e β-DDM deskomponé ta wòrdu mustra den gris, i e oksígeno ta wòrdu mustra den kòrá. (G) E bista den (F) ta wòrdu rotá 180°, ku e residuonan prominente di e polipeptido alfa marká.
Protein-W ta remplasá un heterodímero αβ (e di 15 den Figura 1F), preveniendo asina seramentu di buèlta i inkliná e promé tres heterodímeronan αβ. A opservá ku e ángulo di inklinashon máksimo di e promé heterodímero αβ-1 relashoná ku e pelíkula normal tabata 25° pa 29° (Figura 1, A i E), ku a wòrdu formá dor di e inklinashon di 2° pa 8° di αβ-1 den RC A sharp contrast-LH116 (Figura 1, B i F). E di dos i di tres heterodímero ta inkliná na 12° pa 22° i 5° pa 10°, respektivamente. Debí na e opstákulo stériko di RC, e inklinashon di αβ-1 no ta inkluí e di dos par di αβ (ku ta korespondé na e di 16 αβ den Figura 1F), formando asina un espasio kla den e ring di LH1 (Figura 1, A i E) . Debí na e falta di dos heterodímero αβ, kompañá pa e pèrdida di kuater BChl i dos karotenoide, ningun di e karotenoidenan ta mara na e subunidad αβ-1 twist, loke ta resultá den un renchi LH114-W ku ta kontené 13 karotenoide Vegetarian i 28 BChls. E kalkulashonnan di resolushon lokal di e dos komplehonan den e regionnan αβ1 pa 7 ta mas abou ku esnan di e restu di e buèlta LH1, loke por reflehá e plastisidat inherente di e subunidat LH1 banda di e sitio di RC QB (Figura 4) .
E potrètnan di RC-LH114-W (A i B) i RC-LH116 (C i D) ta wòrdu mustra for di e mesun bista ariba/bista banda (A i B) (A i C) i superfisie di kavidat di Fig. 1. (B i D). E yabinan kolorido ta wòrdu mustra na man drechi.
E úniko otro kompleho di núkleo karakterístiko ku un relashon stoikiométriko di 1:14 ta e Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13). Sinembargo, proteina W i PufX no tin un omologia opvio, i tin un impakto signifikante riba nan respektivo strukturanan di LH1. PufX ta un solo TMH ku un dominio sitoplasmátiko N-terminal ku ta interkambiá ku e parti sitoplasmátiko di e subunidad RC-H (13) na un posishon korespondiente na Rps. palustris LH116αβ-16. PufX ta krea un kanal pa e interkambio di kinona/kinolona entre RC-LH1 i e kompleho di sitokrom bcl i ta presente den tur Rba. kompleho di núkleo di sphaeroides (13). Aunke e interfase monómero-monómero ta den Rba. E dímero di sphaeroides RC-LH1-PufX ta situá na e posishon di unimentu di proteina W den RC-LH114-W, i e espasio indusí pa PufX i proteina-W ta na un posishon ekivalente (Figura S7A). E brecha den RC-LH114-W tambe ta alinia ku e kanal hipotétiko di kinona (8) di Pseudomonas rosea LH1, ku ta wòrdu formá pa peptidenan ku no ta relashoná ku proteina W òf PufX (Figura S7B). Ademas, e kanal di kinona na Blc. E LH1 bèrdè esmeralda formá dor di ekskluí un subunidad γ (7) ta situá den un posishon similar (Figura S7C). Aunke media pa diferente proteina, e aparishon di e kanalnan di kinona/kinolol aki den un posishon komun den e kompleho RC-LH1 ta parse di ta un ehèmpel di evolushon konvergente, indikando ku e espasio kreá pa proteina W por fungi komo un kanal di quinona.
E espasio den e buèlta LH114-W ta pèrmití e formashon di un region di membrana kontinuo entre e espasio interno di e kompleho RC-LH114-W i e membrana di bulk (Figura 1G), en bes di konektá e dos dominionan a traves di un poro di proteina manera den proteina. E kompleho RC-LH116 ta similar na un Tch será. Kompleho manera un aguja (22) (Figura 1H). Komo ku e difushon di kinona a traves di e membrana ta mas lihé ku e difushon a traves di e kanal di proteina smal, e buèlta LH114-W habrí por pèrmití un kambio di RC mas lihé ku e buèlta LH116 será, i e difushon di quinona den e RC por ta mas restringí. Pa por tèst si proteina W ta afektá e kombershon di kinonnan a traves di RC, nos a hasi un ensayo di oksidashon di sitokrom riba un sierto konsentrashon di ubikinon 2 (UQ2) (un análogo di UQ10 natural ku un rabo di isopreno mas kòrtiku) (Figura 2E). Aunke e presensia di kinona kelatá ta stroba e determinashon eksakto di e konstante aparente di Michaelis (RC-LH114-W i RC-LH116 ta adekuá pa 0.2±0.1μM i 0.5±0.2μM, respektivamente), e tasa máksimo di RC-LH114-W ( 4.6±0.20.2μM) ta s-1-s. 28±5% mas grandi ku RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Nos a kalkulá inicialmente ku proteina-W ta presente den mas o ménos 10% di e kompleho di núkleo (16); aki, e tasanan di okupashon di celnan di kresementu di lus abou, lus mediano i lus haltu ta 15±0.6%, 11±1% i 0.9±0.5, respektivamente % (Figura 2F). Komparashon kuantitativo di spektrometria di masa a mustra ku e adishon di tag di histidina no a redusí e abundansia relativo di proteina-W kompará ku strainnan di tipo salbahe (P = 0.59), pues e nivelnan aki no ta un artefakto di proteina-W modifiká (Figura S10). Sinembargo, e okupashon abou aki di proteina-W den e kompleho RC-LH1 por permití algun RC pa flip na un velosidat aselerá, mitigando asina e interkambio di kinona/kinolona mas slow den e kompleho RC-LH116. Nos a nota ku e tasa haltu di okupashon di lus ta inkonsistente ku e datonan transkriptómiko resien, loke ta indiká ku ekspreshon di gene pufW ta oumentá bou di lus fuerte (Figura S11) (23). E diferensia entre transkripshon di pufW i inkorporashon di proteina-W den e kompleho RC-LH1 ta konfuso i por reflehá e regulashon kompleho di e proteina.
Den RC-LH114-W, 6 kardiolipin (CDL), 7 fosfatidilkolina (POPC), 1 fosfatidilgliserol (POPG) i 29 molèkül di β-DDM ta wòrdu aloká i modelá den dje 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG i 12 DMD. RC-LH116 (Figura 5, A i B). Den e dos strukturanan aki, CDL ta kasi situá na e parti sitoplasmátiko di e kompleho, miéntras ku POPC, POPG i β-DDM ta situá mayoria biaha na e parti luminal. Dos molèkül di lípido i detergente a wòrdu isolá den e region αβ-1 pa αβ-6 di e kompleho RC-LH114-W (Figura 5A), i sinku a wòrdu isolá den e region ekivalente di RC-LH116 (Figura 5B ). Mas lipid a wòrdu hañá na e otro banda di e kompleho, prinsipalmente CDL, akumulá entre RC i αβ-7 pa αβ-13 (Figura 5, A i B). Otro lipidonan i detergentenan strukturalmente resolvé ta situá pafó di e ring di LH1, i kadenanan di asil bon resolvé ta ekstendé entre subunidadnan di LH1, tentativamente designá komo β-DDM den RC-LH114-W, i definí komo β-DDM den RC A meskla di β-DDM i PO-LH16-LH16. E posishonnan similar di lipidonan i detergentenan di kelashon den nos struktura ta indiká ku nan ta sitionan di unimentu fisiológikamente relevante (Figura S12A). E posishonnan di molèkülnan ekivalente den Tch tambe tin bon konsistensia. Suave i Trv. Strain 970 RC-LH1s (Figura S12, B pa E) (9, 12) i e residuonan di unimentu di hidrogeno di e grupo di kabes di lípido a mustra basta bon konservashon den e alineashon di sekuensia (Figura S13), indikando ku CDL konservá ku ta mara na RC (24), e sitionan aki por wòrdu konservá den e kompleho RCH-LH1.
(A i B) Peptidenan RC-LH114-W (A) i RC-LH116 (B) ta wòrdu representá pa karikatura, i e pigmentonan ta wòrdu representá pa bara, usando e skema di koló den Figura 1. Lipidonan ta wòrdu mustra na kòrá, i detergentenan ta wòrdu mustra na gris. UQ mará na e sitionan di RC QA i QB ta hel, miéntras ku UQ isolá ta blou. (C i D) E mesun puntonan di bista ku (A) i (B), ku lipidonan omití. (E pa G) Bista engrandesé di Q1(E), Q2(F) i Q3(G) for di RC-LH116, ku kadenanan lateral ku ta influensiá otro. E vínkulonan di hidrogeno ta wòrdu mustra komo liñanan pretu trahá.
Den RC-LH116, tantu RC QA komo QB UQ, ku ta partisipá den transferensia di elektrón den e proseso di separashon di karga, ta wòrdu deskomponé den nan lugánan di uni. Sinembargo, den RC-LH114-W, QB quinone no a wòrdu resolvé i lo wòrdu diskutí den detaye mas abou. Ademas di quinonnan QA i QB, dos molèkül UQ kelá (situá entre e renchinan RC i LH1) ta wòrdu aloká den e struktura RC-LH114-W segun nan gruponan di kabes bon resolvé (situá den Q1 i Q2, respektivamente). espasio). Figura 5C). Dos unidat di isopreno ta wòrdu asigná na Q1, i e mapa di densidat ta resolvé e 10 rabo di isopreno kompleto di Q2. Den e struktura di RC-LH116, tres molèkül di UQ10 kelá (Q1 pa Q3, Figura 5D) a wòrdu resolvé, i tur molèkül tin un densidat kla den henter e rabo (Figura 5, D pa G). Den e dos strukturanan, e posishonnan di e gruponan di kabes di quinona di Q1 i Q2 tin un konsistensia ekselente (Figura S12F), i nan ta interkambiá solamente ku RC. Q1 ta situá na e entrada di e espasio W di RC-LH114-W (Figura 1G i 5, C, D i E), i Q2 ta situá serka di e sitio di unimentu di QB (Figura 5, C, D) i F). E residuonan L-Trp143 i L-Trp269 konservá ta hopi serka di Q1 i Q2 i ta proveé ​​interakshonnan potensial di π-stacking (Figura 5, E i F, i Figura S12). L-Gln88, 3.0 Å for di e oksígeno distal di Q1, ta proveé ​​un enlase di hidrógeno fuerte (Figura 5E); e residuo aki ta wòrdu konservá den tur RC ku eksepshon di e relashon mas leu (Figura S13). L-Ser91 ta wòrdu sustituí konservativamente pa Thr den mayoria di otro RC (Figura S13), ta 3.8 Angstrom for di e metil oksígeno di Q1, i por proveé ​​vínkulonan di hidrógeno debil (Figura 5E). Q3 no ta parse di tin un interakshon spesífiko, pero ta situá den e region hidrofóbiko entre e subunidad RC-M i e subunidad LH1-α 5 pa 6 (Figura 5, D i G). Q1, Q2 i Q3 òf kinonan kelatá den serkania tambe a wòrdu resolvé den Tch. Suave, Trv. Cepa 970 i Blc. E struktura di iris (9, 10, 12) ta mustra riba un sitio di unimentu di kinona ousiliar konservá den e kompleho RC-LH1 (Figura S12G). E sinku UQnan deskomponé den RC-LH116 ta di bon akuerdo ku e 5.8±0.7 di kada kompleho determiná pa kromatografia di líkido di haltu rendimentu (HPLC), miéntras ku e tres UQnan deskomponé den RC-LH114-W ta mas abou ku E balor midi di 6.2±0.3 (Fig. S14) ta indiká ku no tin e molèknan di UQ den resolvé. struktura.
E polipeptidonan pseudo-simétriko L ​​i M kada un ta kontené sinku TMH i ta forma un heterodímero ku ta kombiná un dímero BChl, dos monómero BChl, dos monómero di bakteriófago (BPh), i un heru no-Heme i un òf dos molèkül di UQ10. Pa medio di e presensia di vínkulonan di hidrogeno riba e grupo di keton terminal i su akumulashon konosí den Rps, karotenoidnan ta wòrdu inkorporá den e M-subunit, ku ta wòrdu yamá cis-3,4-dehydroorhodopin. Spesie (25). E dominio di membrana eksterno di RC-H ta ankrá na e membrana dor di un solo TMH. E struktura di RC general ta similar na e tres RC di subunidad di espesienan relashoná (manera Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). E makrosiklonan di BChl i BPh, e wesu di lomba karotenoide i heru no-heme ta overlap denter di e rango di resolushon di e strukturanan aki, meskos ku e grupo di kabes UQ10 na e sitio di QA i e kinona QB na RC-LH116 (Figura S15).
E disponibilidat di dos struktura di RC ku diferente tasa di okupashon di e sitio di QB ta proveé ​​un oportunidat nobo pa analisá e kambionan konformashonal konsistente ku ta kompañá e union di kinona di QB. Den e kompleho RC-LH116, QB quinone ta situá den e posishon “proksimal” kompletamente mará (26), pero e separashon di RC-LH114-W no tin QB quinone. No tin QB quinone den RC-LH114-W, loke ta sorprendente pasobra e kompleho ta aktivo, mas ku e kompleho RC-LH116 ku QB quinone strukturalmente resolvé. Aunke e dos renchinan di LH1 ta kela mas o ménos seis kinona, sinku ta strukturalmente resolvé den e renchi RC-LH116 será, miéntras ku solamente tres ta strukturalmente limitá den e renchi RC-LH114-W habrí. E trastorno struktural oumentá aki por reflehá e remplaso mas rápido di e sitionan di RC-LH114-W QB, e kinétika di quinona mas rápido den e kompleho, i e probabilidat oumentá di krusa e buèlta di LH1. Nos ta sugerí ku e falta di UQ den e sitio di RC QB di RC-LH114-W por ta e resultado di un kompleho mas kompleho i mas aktivo, i e sitio di QB di RC-LH114-W a wòrdu kongelá mesora den e turnover di UQ E fase spesífiko (e entrada na e sitio di QB a wòrdu será) ta reflehá e konformashon di e aktividat aki.
Sin QB, e rotashon kompañante di L-Phe217 na un posishon ku ta inkompatibel ku e unimentu di UQ10, pasobra e lo kousa un kolishon espasial ku e promé unidat di isopreno di e rabo (Figura 6A). Ademas, e kambionan konformashonal prinsipal opvio ta opvio, spesialmente e héliks de (héliks kòrtiku den e buèlta entre TMH D i E) kaminda L-Phe217 ta wòrdu move pa e saku di unimentu di QB i e rotashon di L-Tyr223 (Figura 6A ) Pa kibra e enlase di hidrogeno ku e kuadro di unimentu M-A4 i ta sera e entrada di e unimentu di QB sitio (Figura 6B). E héliks ta pivotá na su base, e Cα di L-Ser209 ta wòrdu move ku 0.33Å, miéntras ku e L-Val221Cα ta wòrdu move ku 3.52Å. No tin kambionan opservabel den TMH D i E, ku ta superponibel den tur dos struktura (Figura 6A). Te kaminda nos sa, esaki ta e promé struktura den e RC natural ku ta sera e sitio di QB. Un komparashon ku e struktura kompleto (QB-bound) ta mustra ku promé ku e kinona wòrdu redusí, un kambio konformashonal ta nesesario pa hasié drenta e kinona. L-Phe217 ta rotá pa forma un interakshon di π-stacking ku e grupo di kabes di quinone, i e héliks ta move pafó, permitiendo e skelet di L-Gly222 i e kadena lateral di L-Tyr223 pa forma un ret di enlase di hidrogeno ku un struktura di enlase di hidrogeno stabil (Figura 6, A i C).
(A) Karikatura ku ta sobrepasá otro di hologram (kadena L, kadena oraño/M, magenta) i struktura apo (gris), den kua e residuonan klave ta wòrdu mustra den forma di un representashon manera bara. UQ10 ta wòrdu representá pa un bara geel. E liña punteá ta indiká e vínkulonan di hidrogeno formá den henter e struktura. (B i C) E representashon di superfisie di e apolipoproteina i henter e struktura di e renchi, resaltando e oksígeno di e kadena lateral di L-Phe217 den blou i L-Tyr223 den kòrá, respektivamente. E subunidad L ta oraño; e subunidatnan M i H no ta kolorido. (D i E) Apolipoprotein (D) i henter (E) RC QB sitionan [kolor pa (A) respektivamente] i Thermophilus thermophilus PSII (bèrdè, blou ku kinona di plèstik; PDB ID: 3WU2) Alineá (58).
Inesperadamente, ounke vários struktura di RCs ku defisiensia di QB sin LH1 ta disponibel, e kambionan konformashonal opservá den e estudio aki no a wòrdu raportá anteriormente. Esakinan ta inkluí e struktura di agotamentu di QB for di Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) i Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), tur di nan ta kasi meskos ku nan struktura QB en general. Inspekshon di aserka di 3PRC a revelá ku molèkülnan di detergente LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) ta mara na entrada di e posishon QB, loke por prevení re-areglo den un konformashon será. Aunke LDAO no ta deskomponé na e mesun posishon den 1EYS òf 1OGV, e RCnan aki ta wòrdu prepará usando e mesun detergente i pues por produsí e mesun efekto. E struktura di kristal di Rba. Sphaeroides RC ko-kristalisá ku sitokrom c2 (PDB ID: 1L9B) tambe ta parse di tin un sitio QB será. Sinembargo, den e kaso aki, e region N-terminal di e polipeptido RC-M (interakshonando ku e sitio di uni QB a traves di e enlase H di e residuo Tyr riba e héliks Q) ta adoptá un konformashon innatural, i e kambio konformashonal QB no ta wòrdu eksplorá mas aleu (30 ). Loke ta trankilisante ta ku nos no a mira e tipo di deformashon aki di e polipeptido M den e struktura RC-LH114-W, ku ta kasi meskos ku e region N-terminal di RC-LH116 RC. Tambe mester tuma nota ku despues di e eradikashon di e antena LH1 basá riba detergente, e RCnan di apolipoproteina den e PDB a keda resolvé, loke a eliminá e poolnan interno di quinona i lipidonan den e espasio entre e RC i e superfisie interno di e ring LH1 rònt di dje (31, 32). RC ta keda funshonal pasobra e ta retené tur kofaktor, ku eksepshon di e kinona QB deskomponibel, ku ta ménos stabil i hopi bia ta bai pèrdí durante e proseso di preparashon (33). Ademas, ta konosí ku e eliminashon di LH1 i lipidonan sikliko natural for di RC por tin un impakto riba funshonnan, manera e durashon di bida kòrtiku di e estado P+QB separá pa karga (31, 34, 35). P’esei, nos ta spekulá ku e eksistensia di e ring LH1 lokal rònt di e RC por mantené e sitio di QB “será”, konserbando asina e ambiente lokal serka di e QB.
Aunke apolipoproteina (sin QB quinone) i e struktura kompleto ta representá solamente dos snapshot di e turnover di e sitio QB, en bes di un seri di evento, tin indikashon ku e union por wòrdu será pa prevení rebinding dor di hydroquinone Pa inhibi inhibishon di substrato. E interakshon di quinolol i quinone serka di e sitio QB di apolipoprotein por ta diferente, loke ta kondusí na su rechaso dor di RC. Pa hopi tempu a wòrdu proponé ku kambionan konformashonal ta hunga un ròl den e unimentu i redukshon di kinonnan. E abilidat di RCnan kongelá pa redusí kinonan despues di adaptashon skur ta afektá (36); Kristalografia di rayo X ta mustra ku e daño aki ta debí na e kinonan QB ku ta wòrdu atrapá den un konformashon “distal” mas o ménos 4.5 Å for di e posishon proksimal aktivo (26) , 37). Nos ta sugerí ku e konformashon di union distal aki ta un instantáneo di e estado intermedio entre apolipoproteina i e struktura di ring kompletu, ku ta sigui e interakshon inisial ku kinona i e apertura di e sitio QB.
E tipo II RC hañá den e kompleho PSII di sierto bakteria fototrófiko i sianobakteria, alga i matanan tin konservashon struktural i funshonal (38). E aliniashon struktural mustra den Figura 6 (D i E) ta enfatisá e similaridat entre PSII RCs i e sitio QB di e kompleho RC bakterial. E komparashon aki pa hopi tempu tabata un modelo pa studia e sistemanan estrechamente relashoná di unimentu i redukshon di kinona. Publikashonnan anterior a sugerí ku kambionan konformashonal ta kompañá pa redukshon di PSII di quinones (39, 40). P’esei, konsiderando e konservashon evolutivo di RC, e mekanismo di uni aki ku no a wòrdu opservá anteriormente por ta aplikabel tambe na e sitio QB di PSII RC den matanan fototrófiko oksigená.
Rps ΔpufW (deleshon di pufW sin etiketa) i PufW-His (C-terminal 10x His-tagged protein-W ekspresá for di e locus natural di pufW) strain. palustris CGA009 a wòrdu deskribí den nos trabou anterior (16). E strainnan aki i e mayor di tipo salbahe isogénico a wòrdu rekuperá for di e frishidèr dor di strepi un kantidat chikitu di sèl riba PYE (kada un 5 g liter -1) (wardá den LB na -80 °C, ku ta kontené 50% ( w/v) gliserol) proteina, ekstrakto di yeast i agar di suksinato [1.5%) (v/v) plachi. E plachi a wòrdu inkubá durante anochi den skuridat na temperatura di kamber bou di kondishonnan anaeróbiko, i despues a wòrdu iluminá ku lus blanku (~50 μmolm-2 s-1) suministrá pa OSRAM 116-W halogen bulbs (RS Components, UK) pa 3 pa 5 dia te ora ku un solo kolonia a aparesé. Un solo kolonia a wòrdu usá pa inokulá 10 ml di medio M22+ (41) suplementá ku 0.1% (p/v) di kasamino asido (aki despues referí na dje komo M22). E kultura a wòrdu kultivá bou di kondishonnan di oksígeno abou den skuridat na 34°C ku sagudí na 180 rpm pa 48 ora, i despues 70 ml di e kultura a wòrdu inokulá bou di e mesun kondishonnan pa 24 ora. Un kultura semi-aerobiko ku un volúmen di 1 ml ta wòrdu usá pa inokulá 30 ml di medio M22 den un bòter di glas transparente universal di 30 ml ku skru i ta wòrdu irradiá ku agitashon (~50μmolm-2 s-1) pa 48 ora pa forsa magnétiko steril Stirring rod. Despues 30 ml di e kultura a wòrdu inokulá ku mas o ménos 1 liter di kultura bou di e mesun kondishonnan, ku despues a wòrdu usá pa inokulá mas o ménos 9 liter di kultura iluminá na ~200 μmolm-2 s-1 pa 72 ora. E sèlnan a wòrdu kosechá dor di sentrifugashon na 7132 RCF pa 30 minüt, resuspendé den ~10 ml di 20 mM tris-HCl (pH 8.0), i wardá na -20°C te ora ku ta nesesario.
Despues di deskongelá, agregá algun kristal di deoksiribonukleasa I (Merck, Reino Uni), lisozima (Merck, Reino Uni) i dos tableta di inhibidor di proteasa di holoenzima Roche (Merck, Reino Uni) na e sèlnan resuspendé. Den un sèl di preshon franses di 20.000 psi (Aminco, Merka), e sèlnan a wòrdu strobá 8 pa 12 biaha. Despues di kita sèlnan no kibra i debris insolubel dor di sentrifugashon na 18.500 RCF pa 15 minüt na 4°C, e membrana a wòrdu presipitá for di e lisato pigmentá dor di sentrifugashon na 113.000 RCF pa 2 ora na 43.000°C. Descartá e frakshon solubel i resuspendé e membrana kolorido den 100 pa 200 ml di 20 mM tris-HCl (pH 8.0) i homogeneisá te ora no tin agregadonan visibel. E membrana suspendé a wòrdu inkubá den 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, Merka) ku ta kontené 2% (p/v) β-DDM pa 1 ora den skuridat na 4°C ku agitashon suave. Despues sentrifugá na 70°C pa disolvé 150.000 RCF na 4°C pa 1 ora pa kita insolubelnan residual.
E membrana solubilisante di e strain ΔpufW a wòrdu apliká na un kolumna di interkambio di ion di DEAE Sepharose di 50 ml ku tres volúmen di kolumna (CV) di buffer di uni [20 mM tris-HCl (pH 8.0) ku ta kontené 0.03% (w / v) β-DDM]. Laba e kolumna ku dos tampón di uni CV, i despues laba e kolumna ku dos tampón di uni ku ta kontené 50 mM NaCl. E kompleho RC-LH116 a wòrdu eluí ku un gradiente lineal di 150 pa 300 mM NaCl (den buffer di uni) riba 1.75 CV, i e kompleho di uni ku a sobra a wòrdu eluí ku un buffer di uni ku ta kontené 300 mM NaCl riba 0.5 CV. Kolektá e spektrum di absorshon entre 250 i 1000 nm, tene e frakshon ku un relashon di absorshon (A880/A280) mas grandi ku 1 na 880 pa 280 nm, diluí esaki dos biaha den e buffer di uni, i usa e mesun prosedura atrobe riba e kolumna di DEAE Riba purifikashon. Diluí e frakshonnan ku rasionan A880/A280 mas haltu ku 1.7 i rasionan A880/A805 mas haltu ku 3.0, hasi e di tres rònt di interkambio di ion, i retené frakshonnan ku rasionan A880/A280 mas haltu ku 2.2 i rasionan A880/A805 mas haltu ku 0.5.0. E kompleho parsialmente purifiká a wòrdu konsentrá na ~2 ml den un filter sentrífugo di peso molekular di kòrtamentu (MWCO) Amicon 100,000 (Merck, UK), i kargá riba un kolumna di eksklushon di tamaño Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) ku ta kontené 200 mM NaCl, i despues a wòrdu eluí den e mesun buffer na e mesun buffer. CV. Kolektá e spektronan di absorshon di e frakshon di eksklushon di tamaño, i konsentrá e spektronan di absorshon ku rasionan A880/A280 riba 2.4 i rasionan A880/A805 riba 5.8 pa 100 A880, i usa nan mesora pa preparashon di grid di krio-TEM òf almasenamentu Mantené na -80°C nesesario.
E membrana solubilisante di e strain di PufW-His a wòrdu apliká na un kolumna di 20 ml di HisPrep FF Ni-NTA Sepharose (20 mM tris-HCl (pH 8.0) ku ta kontené 200 mM NaCl i 0.03% (w/w)) den buffer IMAC ( GE Healthcare). v) β-DDM]. E kolumna a wòrdu labá ku sinku CV di buffer IMAC, i despues ku sinku CV di buffer IMAC ku ta kontené 10 mM di histidina. E kompleho di núkleo a wòrdu eluí for di e kolumna ku sinku buffer di IMAC ku ta kontené 100 mM di histidina. E frakshon ku ta kontené e kompleho RC-LH114-W ta wòrdu konsentrá te na ~10 ml den un tanki agitá ekipá ku un filter Amicon 100,000 MWCO (Merck, UK), diluí 20 biaha ku tampón di uni, i despues agregá na 25 ml Den e kolumna di DEAE Sepharose, kuater tampón di CV b ta wòrdu usá di antemano. Laba e kolumna ku kuater tampón di uni CV, despues eluí e kompleho riba ocho CV riba un gradiente lineal di 0 pa 100 mM NaCl (den tampón di uni), i e kuater CVnan ku ta kontené 100 mM tampón di uni E komplehonan residual eluí riba e klorido di sodio kombiná ku e relashon A8888/800 i mas haltu ku 2004. A880/A805 rasio mas haltu ku 4.6 frakshonnan a wòrdu konsentrá na ~2 ml den un filter sentrífugo Amicon 100,000 MWCO, i yená ku 1.5 CV IMAC di antemano Buffer a ekilibrá Superdex 200 16/600 di tamaño di kolumna di eksklushon, i despues a wòrdu eluí den e mesun buffer riba 1.5 CV. Kolektá e spektronan di absorshon di e frakshonnan di eksklushon di tamaño i konsentrá e spektronan di absorshon ku rasionan A880/A280 riba 2.1 i rasionan A880/A805 riba 4.6 pa 100 A880, ku ta wòrdu usá mesora pa preparashon di grid di TEM kongelá òf warda na -80°C te ora nesesario.
Un frishidèr di inmershon Leica EM GP a wòrdu usá pa prepará gridnan di TEM di temperatura abou. E kompleho a wòrdu diluí den un buffer di IMAC te na A880 di 50, i despues 5μl a wòrdu kargá riba un QUANTIFOIL 1.2/1.3 ku ta wòrdu kubri ku karbon (Agar Scientific, UK). Inkubá e grid na 20°C i 60% di humedat relativo pa 30 s, despues seka esaki pa 3 s, i despues paga esaki den etano líkido na -176°C.
E datonan di e kompleho RC-LH114-W a wòrdu registrá riba e eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) ku un mikroskop Titan Krios, ku ta traha na un voltahe di aselerashon di 300kV, ku un magnifikashon nominal di 130.000× i un energia di un espasio di 200kV. Un Gatan 968 GIF Quantum ku detektor di punta K2 a wòrdu usá pa graba imágennan den modo di kontamentu pa rekohé dato. E tamaño di piksel kalibrá ta 1.048Å, i e tasa di dosis ta 3.83 e-Å-2s-1. A rekohé e pelíkula den 11 sekònde i a dividí esaki den 40 parti. Usa e área ku ta kubri ku karbon pa enfoká e mikroskop di nobo, i despues rekohé tres pelíkula pa buraku. En total, 3130 pelíkula a wòrdu rekohé, ku balornan di desenfoke entre -1 i -3μm.
E datonan pa e kompleho RC-LH116 a wòrdu rekohé usando e mesun mikroskop na e Laboratorio di Biostruktura di Asterbury (Universidat di Leeds, Reino Uni). E datonan a wòrdu rekohé den moda di kontamentu ku un magnifikashon di 130 k, i e tamaño di piksel a wòrdu kalibrá na 1.065 Å ku un dosis di 4.6 e-Å-2s-1. E pelíkula a wòrdu grabá den 12 sekònde i dividí den 48 parti. En total, 3359 pelíkula a wòrdu rekohé, ku balornan di desenfoke entre -1 i -3μm.
Tur prosesamentu di dato ta wòrdu realisá den e pipeline di Relion 3.0 (42). Usa Motioncorr 2 (43) pa drecha e moveshon di e rayo dor di peso di dosis, i despues usa CTFFIND 4.1 (44) pa determiná e parameter CTF (funshon di transferensia di kontraste). Fotomikrografonan típiko despues di e fasenan di prosesamentu inisial aki ta wòrdu mustra den Figura 2. S16. E plantilla di selekshon outomátiko ta wòrdu generá dor di selekshoná manualmente alrededor di 250 piksel di 1000 partikulo den un kuadro di 250 piksel i sin referensia di klasifikashon bidimenshonal (2D), rechasando asina e klasifikashonnan ei ku ta kumpli ku kontaminashon di muestra òf no tin karakterístikanan distinguibel. Despues, a hasi selekshon outomátiko riba tur e mikrofotografianan, i e RC-LH114-W tabata 849.359 partikulo, i e kompleho RC-LH116 tabata 476.547 partikulo. Tur partikulo selektá a pasa dor di dos rònt di klasifikashon 2D no-referensia, i despues di kada kareda, e partikulonan ku ta kumpli ku e área di karbon, kontaminashon di muestra, no tin karakterístika opvio òf partikulonan ku ta overlap fuertemente ta wòrdu rechasá, loke ta resultá den 772.033 (90.9%) i 359.678 (75.5) partikulo ta wòrdu usá pa klasifikashon di 3D D. RC-LH114-W i RC-LH116 respektivamente. E modelo di referensia 3D inisial a wòrdu generá usando e método di bahada di gradiente stokástiko. Usando e modelo inisial komo referensia, e partikulonan selektá ta wòrdu klasifiká den kuater kategoria den 3D. Usando e modelo den e kategoria aki komo referensia, hasi refinamentu 3D riba e partikulonan den e kategoria mas grandi, despues usa e filter di low-pass inisial di 15Å pa kubri e área di solvente, agregá 6 piksel di rand suave, i post-prosesá e pikselnan pa koregí e funshon di transferensia di modulashon di punta di Gatan K2 di e detektor di mas haltu. Pa e sèt di dato RC-LH114-W, e modelo inisial aki a wòrdu modifiká dor di kita e densidat fuerte na e randnan di e maskarada (deskonektá for di e densidat di e kompleho di núkleo den UCSF Chimera). E modelonan resultante (e resolushonnan di RC-LH114-W i RC-LH116 ta 3.91 i 4.16 Å, respektivamente) ta wòrdu usá komo un referensia pa e di dos buèlta di klasifikashon 3D. E partikulonan usá ta wòrdu agrupá den e klase 3D inisial i no ta kontené un korelashon fuerte ku e bario. Overlap òf falta di karakterístikanan struktural opvio. Despues di e di dos rònt di klasifikashon 3D, a selektá e kategoria ku e resolushon mas haltu [Pa RC-LH114-W, un kategoria ta 377.703 partikulo (44.5%), pa RC-LH116, tin dos kategoria, ku ta totalisá 260.752 partikulo (54.7% W), solamente ora nan ta liña despues di e mesunnan despues di e mesunnan rotashon inisial ku un diferensia chikitu]. E partikulonan selektá ta wòrdu re-ekstraí den un kaha di 400 piksel i ta wòrdu refiná dor di refiná 3D. E maskarada di solvente ta wòrdu generá usando e filter di pasa abou inisial di 15Å, ekspanshon di mapa di 3 piksel i maskarada suave di 3 piksel. Usando refinamentu di CTF pa partikulo, korekshon di moveshon pa partikulo i e di dos buèlta di refinamentu di CTF pa partikulo, refinamentu 3D, enmaskaramentu di solvente i post-prosesamentu ta wòrdu realisá despues di kada paso pa sigui refiná e tekstura resultante. Usando e balor di kòrtamentu di FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) di 0.143, e resolushonnan di e modelonan final di RC-LH114-W i RC-LH116 ta 2.65 i 2.80Å, respektivamente. E kurva di FSC di e modelo final ta wòrdu mustra den Figura 2. S17.
Tur sekuensia di proteina ta wòrdu download for di UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) a wòrdu usá pa konstruí un modelo di homologia di RC, ku ta kontené e sekuensianan di proteina di RC-L, RC-M i RC-H i e struktura di kristal di Rba. sphaeroides RC a wòrdu usá komo un plantilla (PDB ID: 5LSE) (46). Usa e herment “mapa di fit” den UCSF Chimera pa fit e modelo generá na e mapa (47), mehorá e struktura di proteina, i kofaktor [4×BChl a (nòmber di residuo di biblioteka di monómero = BCL), 2×BPh a (BPH), un òf dos tipo di UQ10 (U10), un heru no-heme (Fe) i un 34 heksadikarilin. (QAK)] usa Coot (48) pa agregá. Komo ku QAK no ta disponibel den e biblioteka di monómero, el a wòrdu parametrisá usando e herment eLBOW den PHENIX (49).
Siguientemente, e subunidad LH1 a wòrdu konstruí. Inicialmente, e herment di konstrukshon outomátiko den PHENIX (49) a wòrdu usá pa konstruí outomatikamente parti di e sekuensia LH1 usando e mapa i e sekuensianan di proteina LH1-α i LH1-β komo entrada. Selektá e subunidat LH1 mas kompleto, saka esaki i karg’é den Coot, agregá e sekuensia ku falta den dje manualmente, i refiná henter e struktura manualmente promé ku agregá dos BCls a (BCL) i un spiriloxanthin (CRT) [di akuerdo ku e Rps relevante E densidat di e kompleho LH1 i e kontenido konosí di karotenoide. Spesie (17)]. Kopia e subunidad kompleto di LH1, i usa e UCSF Chimera “Docking Map Tool” pa mara den e área no-modelo besindario di densidat di LH1, i despues refiná esaki den Coot; ripití e proseso te ora ku tur subunidat di LH1 a wòrdu modelá. Pa e struktura RC-LH114-W, dor di saka e densidat no aloká den e Coot, e proteina ta wòrdu segmentá for di e komponentenan no-protein ku ta sobra den e mapa di USCF Chimera i e herment di Autobuild ta wòrdu usá pa establesé e modelo inisial, i e subunidatnan ku ta sobra (protein-W) Modeling. Na PHENIX (49). Agregá kualke sekuensia ku falta na e modelo resultante den Coot (48), i despues refiná henter e subunidad manualmente. E densidat no aloká ku ta sobra ta kuadra ku e kombinashon di lipidonan (ID di biblioteka di monómero PDB di CDL = CDL, POPC = 6PL i POPG = PGT), detergente β-DDM (LMT) i molèkülnan UQ10 (U10). Usa optimalisashon di PHENIX (49) i optimalisashon manual den Coot (48) pa perfekshoná e modelo inisial kompleto te ora ku e estadístika di e modelo i e kalidat visual di e fit no por wòrdu mehorá mas aleu. Finalmente, usa LocScale (50) pa skerpi e mapa lokal, i despues hasi vários otro siklo di modelashon di e densidat no aloká i optimalisashon outomátiko i manual.
E respektivo peptidenan, kofaktornan i otro lipidonan i kinonan ankrá den nan respektivo densidatnan ta wòrdu mustra den Figuranan 1 i 2. S18 pa S23. E informashon estadístiko di e modelo final ta wòrdu mustra den Tabel S1.
A ménos ku ta spesifiká otro, e spektronan di absorshon UV/Vis/NIR a wòrdu rekohé riba un spektrofotometer Cary60 (Agilent, Merka) na intervalonan di 1 nm di 250 nm pa 1000 nm i un tempu di integrashon di 0.1s.
Diluí e muestra den un kuveta di kuarso ku un trayekto di 2 mm pa A880 di 1, i rekohé e spektrum di absorshon entre 400 i 1000 nm. E spektronan dikroiko sirkulá a wòrdu rekohé riba un spektropolarimetro Jasco 810 (Jasco, Hapon) na intervalonan di 1 nm entre 400 nm i 950 nm na un velosidat di skan di 20 nm min-1.
E koefisiente di ekstinshon molar ta wòrdu determiná dor di diluí e kompleho di núkleo na un A880 di aproksimadamente 50. Diluí e volúmen di 10μl den 990μl di tampón di uni òf metanol, i rekohé e spektrum di absorshon mesora pa minimalisá degradashon di BChl. E kontenido di BChl di kada muestra di metanol a wòrdu kalkulá dor di e koefisiente di ekstinshon na 771 nm di 54.8 mM-1 cm-1, i e koefisiente di ekstinshon a wòrdu determiná (51). Dividí e konsentrashon di BChl midi pa 32 (RC-LH114-W) òf 36 (RC-LH116) pa determiná e konsentrashon di e kompleho di núkleo, ku despues ta wòrdu usá pa determiná e spektrum di absorshon di e mesun muestra rekohé den e koefisiente di Ekstinshon di buffer. paralelo. Tres midimentu ripití a wòrdu tumá pa kada muestra, i e absorbensia promedio di e máksimo di BChl Qy a wòrdu usá pa kalkulashon. E koefisiente di ekstinshon di RC-LH114-W midi na 878 nm ta 3280±140 mM-1 cm-1, miéntras ku e koefisiente di ekstinshon di RC-LH116 midi na 880 nm ta 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 a wòrdu kalkulá segun e método den (52). Den kòrtiku, HPLC di fase inverso (RP-HPLC) a wòrdu realisá usando e sistema di HPLC Agilent 1200. Disolvé alrededor di 0.02 nmol di RC-LH116 òf RC-LH114-W den 50μl di 50:50 metanol:kloroformo ku ta kontené 0.02% (p/v) klorido fériko, i inyektá e pre-ekilibrá Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4mml disolvé den 1-1-min. 40°C den solvente HPLC (80:20 metanol:2-propanol) riba un kolumna di ×25 cm. Hasi elushon isokrátiko den un solvente HPLC pa monitor absorbensia na 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoids) i 780 nm (BChl) pa 1 ora. E piku den e kromatogram di 275 nm na 25.5 minüt a wòrdu integrá, ku no tabata kontené ningun otro komponente detektabel. E área integral ta wòrdu usá pa kalkulá e kantidat molar di UQ10 ekstraí ku referensia na e kurva di kalibrashon kalkulá for di e inyekshon di normanan puru di 0 pa 5.8 nmol (Figura S14). Kada muestra a wòrdu analisá den tres replika, i e eror raportá ta korespondé na e SD di e promedio.
Un solushon ku ta kontené e kompleho RC-LH1 ku un absorshon máksimo di Qy di 0.1 a wòrdu prepará ku 30 μM di sitokromo c2 di kurason di kabai redusí (Merck, UK) i 0 pa 50 μMUQ2 (Merck, UK). Tres muestra di 1-ml a wòrdu prepará na kada konsentrashon di UQ2 i inkubá durante anochi den skuridat na 4°C pa garantisá adaptashon kompleto na skuridat promé ku midimentu. E solushon a wòrdu kargá den un spektrofotometer modular OLIS RSM1000 ekipá ku un 300 nm flame/500 line grating, 1.24 mm di entrada, 0.12 mm di meimei i 0.6 mm di salida. Un filter di pasa largu di 600 nm ta wòrdu poné na entrada di e fototubo di muestra i e tubo di fotomultiplikadó di referensia pa ekskluí lus di eksitashon. E absorbensia a wòrdu monitoriá na 550 nm ku un tempu di integrashon di 0.15 s. E lus di eksitashon ta wòrdu emití for di e 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) a traves di un kabel di fibra optiko na 90% di intensidat a traves di un kontroladó DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) i ta wòrdu emití na e fuente di lus na un ángulo di 90°. E rayo di midi ta kontrali na e spiel pa debolbé kualke lus ku no a wòrdu apsorbé inicialmente dor di e muestra. Monitor e absorbensia 10 s promé ku e iluminashon di 50 s. Despues e absorbensia a wòrdu monitoriá mas aleu pa 60 s den skuridat pa evaluá e grado na kua quinolol ta redusí sitokrom c23 + spontáneamente (wak Figura S8 pa datonan brutu).
E datonan a wòrdu prosesá dor di fit un tasa inisial lineal denter di 0.5 pa 10 s (dependiendo di e konsentrashon di UQ2) i averahe e tasanan di tur tres muestra na kada konsentrashon di UQ2. E konsentrashon di RC-LH1 kalkulá pa e koefisiente di ekstinshon respektivo a wòrdu usá pa kombertí e tasa den e efisiensia katalítiko, trahá den Origin Pro 2019 (OriginLab, Merka), i ahusta na e modelo di Michaelis-Menten pa determiná e balornan aparente di Km i Kcat.
Pa midimentunan di absorshon transitorio, e muestra di RC-LH1 a wòrdu diluí na ~2μM den un buffer di IMAC ku ta kontené 50 mM di askorbato di sodio (Merck, Merka) i 0.4 mM di Terbutin (Merck, Merka). Askorbiko ta wòrdu usá komo un donante di elektrón sakrifisial, i tert-butaclofen ta wòrdu usá komo un inhibidor di QB pa garantisá ku e donante prinsipal di RC ta keda redusí (esta, no fotooksida) durante henter e proseso di midimentu. Mas o ménos 3 ml di muestra ta wòrdu agregá na un sèl rotativo personalisá (mas o ménos 0.1 m di diameter, 350 RPM) ku un largura di trayekto optiko di 2 mm pa garantisá ku e muestra den e trayekto di laser tin sufisiente tempu pa adaptashon skur entre pulsonan di eksitashon. Usa ~100-fs pulsonan di laser pa amplifiká e sistema di laser Ti: Sapphire (Spectra Physics, Merka) pa eksitá e muestra na 880 nm na un velosidat di ripitishon di 1 kHz (20 nJ pa NIR òf 100 nJ pa Vis). Promé ku rekohé dato, eksponé e muestra na lus di eksitashon pa mas o ménos 30 minüt. Eksposishon lo kousa inaktivashon di QA (posiblemente redusiendo QA un òf dos biaha). Pero por fabor tene na kuenta ku e proseso aki ta reversibel pasobra despues di un periodo largu di adaptashon skur, RC lo regresá pokopoko na aktividat di QA. Un spektrometer Helios (Ultrafast Systems, Merka) a wòrdu usá pa midi spektronan transitorio ku un tempu di retraso di -10 pa 7000 ps. Usa e software di Surface Xplorer (Ultrafast Systems, Merka) pa desgrupá e setnan di dato, despues uni i standardisá. Usa e pakete di software CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) pa usa e set di dato kombiná pa optené spektronan diferensial relashoná ku dekadensia, òf usa un funshon ku ta konvolví múltiple eksponente ku e kontesta di e instrumento pa kuadra ku e evolushon spektral di un solo longitud di ola den Origin (OriginLab, Merka).
Manera menshoná ariba (53), un pelíkula fotosintétiko ku ta kontené kompleho LH1 ku no tin tantu RC komo antena LH2 perifériko a wòrdu prepará. E membrana a wòrdu diluí den 20 mM tris (pH 8.0) i despues a wòrdu kargá den un kuveta di kuarts ku un trayekto optiko di 2 mm. Un pulso di laser di 30nJ a wòrdu usá pa eksitá e muestra na 540 nm ku un tempu di retraso di -10 pa 7000 ps. Prosesá e sèt di dato manera deskribí pa Rps. muestra di pal.
E membrana a wòrdu pellet dor di sentrifugashon na 150.000 RCF pa 2 ora na 4°C, i despues su absorbensia na 880 nm a wòrdu resuspendé den 20 mM tris-HCl (pH 8.0) i 200 mM NaCl. Disolvé e membrana dor di stir poko poko den 2% (p/v) β-DDM pa 1 ora den skuridat na 4°C. E muestra a wòrdu diluí den 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) te na un konsentrashon di proteina di 2.5 mg ml-1 (análisis di Bio-Rad). Mas prosesamentu a wòrdu realisá for di e método publiká anteriormente (54), kuminsando ku e dilushon di 50 μg di proteina den un total di 50 μl TEAB ku ta kontené 1% (p/v) laurato di sodio (Merck, UK). Despues di sonikashon pa 60 s, el a wòrdu redusí ku 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (Merck, UK) na 37°C pa 30 minüt. Pa S-alkilashon, inkubá e muestra ku 10 mM di methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) i agregá esaki for di un solushon di 200 mM di isopropanol pa 10 minüt na temperatura di kamber. Digestion proteolítiko a wòrdu realisá dor di agregá 2 μg di meskla di trypsin/endoproteinase Lys-C (Promega UK) i inkubá na 37°C pa 3 ora. E surfaktante di laurato a wòrdu ekstraí dor di agregá 50 μl di asetat di etilo i 10 μl di 10% (v/v) asido trifluoroasético di grado LC (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) i vortexing pa 60 s. E separashon di fase a wòrdu promové dor di sentrifugashon na 15.700 RCF pa 5 minüt. Di akuerdo ku e protokòl di e fabrikante, un kolumna di spin C18 (Thermo Fisher Scientific, Reino Uni) a wòrdu usá pa aspirá i desalu kuidadosamente e fase mas abou ku ta kontené e peptide. Despues di seku pa medio di sentrifugashon den vakuo, e muestra a wòrdu disolvé den 0.5% TFA i 3% asetonitrilo, i 500 ng a wòrdu analisá pa medio di kromatografia di nanoflow RP kombiná ku spektrometria di masa usando e parameternan di sistema detayá anteriormente.
Usa MaxQuant v.1.5.3.30 (56) pa identifikashon i kuantifikashon di proteina pa buska Rps. base di dato di proteoma palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). E datonan di proteómika di spektrometria di masa a wòrdu depositá den e ProteomeXchange Alliance a traves di e repositorio di partner PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) bou di e identifikadó di sèt di dato PXD020402.
Pa analisis pa medio di RPLC huntu ku spektrometria di masa di ionisashon di elektrospray, e kompleho RC-LH1 a wòrdu prepará for di Rps di tipo salbahe. Usando e método publiká anteriormente (16), e konsentrashon di proteina produsí den celnan di palustris tabata 2 mg ml-1 den 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl i 0.03% (w/v) β- (análisis di Bio-Rad) ) DDM. Di akuerdo ku e protokòl di e fabrikante, usa e kit di purifikashon 2D (GE Healthcare, Merka) pa saka 10 μg di proteina pa medio di método di presipitashon, i disolvé e presipitashon den 20 μl 60% (v / v) di asido fórmiko (FA), 20% (v / v) Acetonitrile i 20% (v/v) di awa. Sinku mikroliter a wòrdu analisá pa RPLC (Dionex RSLC) huntu ku spektrometria di masa (Maxis UHR-TOF, Bruker). Usa kolumna di MabPac 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) pa separashon na 60°C i 100μlmin -1, ku un gradiente di 85% (v / v) solvente A [0.1% (v / v) FA i 0.02% (V/v) TFA solushon akuoso] pa solvente(v / v) 85%/v) [0.1%(v/v) FA i 0.02%(v/v) den 90%(v/v) acetonitrile TFA] Usando fuente di ionisashon di elektrospray standart i parameternan predeterminá pa mas ku 60 minüt, e spektrómeter di masa ta optené 100 pa 2750 m/z (ratio di karga di masa). Ku yudansa di e portal di rekurso di bioinformatika di ExPASy FindPept tool (https://web.expasy.org/findpept/), mapa e spektrum di masa na e subunidatnan di e kompleho.
E sèlnan a wòrdu krese pa 72 ora bou di 100 ml di lus NF-abou (10μMm-2 s-1), mediano (30μMm-2 s-1) òf haltu (300μMm-2 s-1). Medio M22 (medio M22 den kua ta omiti sulfato di amonio i ta remplasá suksinato di sodio pa asetato di sodio) den un bòter di 100 ml ku schroef (23). Den sinku siklo di 30-s, a kralchi di glas di 0.1 mikron na un proporshon di volúmen di 1:1 pa lisa e sèlnan i a fria riba ijs pa 5 minüt. E materia insolubel, celnan no kibra i kralnan di glas a wòrdu kita dor di sentrifugashon na 16.000 RCF pa 10 minüt den un mikrosentrifuga riba banki. E membrana a wòrdu separá den un rotor Ti 70.1 ku 100.000 RCF den 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ku un gradiente di sukrosa di 40/15% (p/w) pa 10 ora.
Manera deskribí den nos trabou anterior, imunodetekshon di e tag di His riba PufW (16). Den kòrtiku, e kompleho di núkleo purifiká (11.8 nM) òf e membrana ku ta kontené e mesun konsentrashon di RC (determiná dor di oksidashon kitando e spektrum di diferensia redusí i ku ta kuadra ku e karga riba e gel mancha) den 2x SDS loading buffer (Merck, UK) diluí dos biaha. E proteinanan a wòrdu separá riba un replika di 12% bis-tris NuPage gel (Thermo Fisher Scientific, UK). Un gel a wòrdu mancha ku Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) pa karga i visualisá e subunidad RC-L. E proteina riba e di dos gel a wòrdu transferí pa e membrana di polivinilideno fluoruro (PVDF) aktivá pa metanol (Thermo Fisher Scientific, UK) pa imunoensayo. E membrana di PVDF a wòrdu blòkiá den 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 i 5% (p / v) di lechi desnata, i despues a wòrdu inkubá ku e anti-His antikurpa primario (den Dilute e buffer di anti-His [50 mM tris-HCl (HM 7.6), 150 mM NaCl i 0.05% (v/v) Tween-20] den 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, Merka) pa 4 ora. Despues di laba 3 biaha pa 5 minüt den un buffer di antikurpa, e membrana a wòrdu kombiná ku anti-korpo sekundario anti-mouse peroxidase (Sigma-Aldrich, UK) (diluí 1:10,000 den un buffer di antikurpa) Inkubá pa permití detekshon (5 minüt despues di 3 labamentu den un buffer di antikurpa) usando WAR EST 2000. substrato di kimioluminisensia (Cyanagen, Italia) i Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Reino Uni).
Dor di traha e distribushon di intensidat di kada gel mancha òf liña di imunoensayo, integrando e área bou di e piku i kalkulá e relashon di intensidat di RC-L (gel mancha) i Protein-W (immunoensayo), den ImageJ (57) Prosesá e imágen. E proporshonnan aki a wòrdu kombertí den proporshonnan molar dor di asumí ku e relashon di RC-L pa proteina-W den e muestra puru di RC-LH114-W tabata 1:1 i normalisá henter e sèt di dato di akuerdo ku esei.
Pa materialnan suplementario pa e artíkulo aki, por fabor wak http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
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David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Andrew C. Necoil Necoilter.
E struktura di resolushon haltu di e kompleho di trampa di lus 1 den e sentro di reakshon ta duna bista nobo riba e dinámika di kinona.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Andrew C. Necoil Necoilter.
E struktura di resolushon haltu di e kompleho di trampa di lus 1 den e sentro di reakshon ta duna bista nobo riba e dinámika di kinona.
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